Uyarılmış kök hücreler - Induced stem cells

Uyarılmış kök hücreler ( iSC ), kasıtlı epigenetik yeniden programlama ile somatik , üreme , pluripotent veya diğer hücre tiplerinden türetilen kök hücrelerdir . Bunlar olarak sınıflandırılır totipotent (ITC), Pluripotent (IPSC) veya progenitör (- IMSC da indüklenmiş bir çok potansiyelli progenitör hücre denilen - IMPC çok potansiyelli) ya da unipotent - (iUSC) kendi uygun gelişim potansiyelinin ve farklılaşmanın giderilmesi derecesi . Progenitörler, sözde doğrudan yeniden programlama veya yönlendirilmiş farklılaşma ile elde edilir ve indüklenmiş somatik kök hücreler olarak da adlandırılır .

Üç teknik yaygın olarak kabul edilmektedir:

• Somatik hücrelerden alınan çekirdeklerin kendi çekirdeği olmayan bir oosite (yumurta hücresi) nakli ( laboratuarda çıkarıldı)
• Füzyon pluripotent kök hücreleri ile somatik hücre ve
• Yeniden programlama protein faktörlerini kodlayan genetik materyal , rekombinant proteinler kullanılarak somatik hücrelerin kök hücrelere dönüştürülmesi ; microRNA, sentetik, kendi kendini kopyalayan bir polisistronik RNA ve düşük moleküler ağırlıklı biyolojik olarak aktif maddeler.

Doğal süreçler

1895'te Thomas Morgan bir kurbağanın iki blastomerinden birini çıkardı ve amfibilerin kalan kısımdan bütün embriyolar oluşturabildiklerini buldu . Bu, hücrelerin farklılaşma yollarını değiştirebileceği anlamına geliyordu. 1924'te Spemann ve Mangold, hayvan gelişimi sırasında hücre-hücre indüksiyonlarının anahtar önemini gösterdi. Farklılaşmış bir hücre tipindeki hücrelerin diğerine geri dönüşümlü dönüşümüne metaplazi denir . Bu geçiş, normal olgunlaşma sürecinin bir parçası olabilir veya bir teşvikten kaynaklanabilir.

Bir örnek, yetişkin semender gözlerinde rejenerasyon sırasında retina pigment epitel hücrelerinin olgunlaşması ve nöral retinaya dönüştürülmesi sürecinde iris hücrelerinin lens hücrelerine dönüşümüdür . Bu süreç, vücudun yeni koşullara uygun olmayan hücreleri daha uygun yeni hücrelerle değiştirmesini sağlar. Gelen Drosophila hayali diskler, hücreler, standart farklı farklılaşma durumları arasında, sınırlı sayıda seçim gerekir. Transdeterminasyonun (farklılaşma yolunun değişmesi) genellikle tek hücrelerden ziyade bir grup hücre için meydana gelmesi, olgunlaşmanın bir parçası olmaktan ziyade indüklendiğini gösterir.

Araştırmacılar, embriyoyu organize etmek için pluripotent hücrelere talimat vermek üzere moleküler ve hücresel süreçler zincirini başlatmak için yeterli olacak minimum koşulları ve faktörleri belirleyebildiler . Bunlar göstermiştir gradyanlar karşı bir kemik morfogenetik protein (BMP) ve Nodal , iki transforme edici büyüme faktörü olarak işlev aile üyelerinin morfojenlerin , moleküler ve hücresel mekanizmalar uyarılması için yeterli olan, düzenlemek için gerekli vivo ya da in vitro , kaydedilmemiş hücreleri arasında zebra balığı blastulanın iyi gelişmiş bir embriyoya hayvan direği .

Bazı olgun, özelleşmiş yetişkin hücre türleri doğal olarak kök hücrelere dönüşebilir. Örneğin, "baş" hücreler kök hücre belirteci Troy'u ifade eder. Normalde mide için sindirim sıvıları üretirken, kesik veya enfeksiyondan kaynaklanan hasar gibi mide yaralanmalarında geçici onarımlar yapmak için kök hücrelere dönüşebilirler. Üstelik, bu geçişi, gözle görülür yaralanmaların yokluğunda bile yapabilirler ve özünde hareketsiz "yedek" kök hücreler olarak hizmet eden tüm mide birimlerini yenileyebilirler. Farklılaşmış hava yolu epitel hücreleri, in vivo olarak stabil ve fonksiyonel kök hücrelere dönüşebilir . Yaralanmadan sonra, olgun terminal olarak farklılaşmış böbrek hücreleri, kendilerinin daha ilkel versiyonlarına farklılaşır ve daha sonra hasarlı dokuda değiştirilmesi gereken hücre tiplerine farklılaşır. Makrofajlar, olgun farklılaşmış hücrelerin lokal proliferasyonu ile kendini yenileyebilir. Yenilerde, kas dokusu, farklılaşan ve eskiden olduğu hücre tipini unutan özel kas hücrelerinden yenilenir. Bu yenilenme kapasitesi yaşla birlikte azalmaz ve talep üzerine kas hücrelerinden yeni kök hücreler üretme yetenekleriyle bağlantılı olabilir.

Çeşitli nontümorijenik kök hücreler, birden fazla hücre tipi oluşturma yeteneğini gösterir. Örneğin, çok soylu farklılaşan strese dayanıklı (Muse) hücreler, kendini yenileyebilen strese dayanıklı yetişkin insan kök hücreleridir. Süspansiyon kültüründe pluripotens ile ilişkili bir dizi gen ifade eden ve hem in vitro hem de in vivo endodermal , ektodermal ve mezodermal hücrelere farklılaşabilen karakteristik hücre kümeleri oluştururlar .

Diğer iyi belgelenmiş transdiferansiyasyon örnekleri ve bunların gelişim ve rejenerasyondaki önemi ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

İndüklenmiş totipotent hücreler genellikle somatik hücrelerin somatik hücre nükleer transferi (SCNT) ile yeniden programlanmasıyla elde edilebilir .

uyarılmış totipotent hücreler

SCNT aracılı

İndüklenmiş totipotent hücreler, somatik hücrelerin somatik hücre nükleer transferi (SCNT) ile yeniden programlanmasıyla elde edilebilir . İşlem, somatik (vücut) bir hücrenin çekirdeğinin emilmesini ve çekirdeği çıkarılmış bir oosit içine enjekte edilmesini içerir.

Tachibana ve diğerleri tarafından ana hatlarıyla belirtilen protokole dayalı bir yaklaşım kullanılarak, hem orta yaşlı 35 yaşındaki bir erkekten hem de 75 yaşındaki yaşlı bir erkekten alınan dermal fibroblast çekirdekleri kullanılarak SCNT tarafından hESC'ler oluşturulabilir. -ilişkili değişiklikler, insan hücrelerinin SCNT tabanlı nükleer yeniden programlanması için mutlaka bir engel değildir. Somatik hücrelerin pluripotent duruma bu şekilde yeniden programlanması, rejeneratif tıp için büyük potansiyeller barındırır . Ne yazık ki, bu teknoloji tarafından üretilen hücreler , hastanın mitokondriyal DNA'sı yerine oosit donörü ile aynı mitokondriyal DNA'ya sahip olduklarından, hastanın bağışıklık sisteminden (çekirdek donörü) potansiyel olarak tamamen korunmazlar . Bu, otolog kök hücre nakli tedavisi için bir kaynak olarak değerlerini azaltır ; günümüze gelince, tedavi üzerine hastanın bir bağışıklık tepkisini indükleyip indükleyemeyeceği açık değildir.

İndüklenmiş androgenetik haploid embriyonik kök hücreler klonlama için sperm yerine kullanılabilir. M fazında senkronize olan ve oosit içine enjekte edilen bu hücreler, canlı yavrular üretebilir.

Bu gelişmeler, mitotik olarak aktif üreme kök hücrelerinden sınırsız oosit olasılığına ilişkin verilerle birlikte, transgenik çiftlik hayvanlarının endüstriyel üretimi olasılığını sunar. Canlı farelerin , hücre kültürü ortamına eklenen bir histon deasetilaz inhibitörü olan trikostatin içeren bir SCNT yöntemiyle tekrar tekrar klonlanması, görünür bir yeniden programlama veya genomik hata birikimi olmaksızın hayvanları süresiz olarak yeniden klonlamanın mümkün olabileceğini göstermektedir. kök hücrelerden sperm ve yumurta hücresi geliştirmek biyoetik sorunları gündeme getirmektedir .

Bu tür teknolojiler, insan oositlerindeki sitoplazmik kusurların üstesinden gelmek için geniş kapsamlı klinik uygulamalara da sahip olabilir. Örneğin, teknoloji, kalıtsal mitokondriyal hastalığın gelecek nesillere geçmesini önleyebilir . Mitokondriyal genetik materyal anneden çocuğa geçer. Mutasyonlar diyabet, sağırlık, göz bozuklukları, gastrointestinal bozukluklar, kalp hastalığı, bunama ve diğer nörolojik hastalıklara neden olabilir. Bir insan yumurtasının çekirdeği, mitokondrileri de dahil olmak üzere diğerine aktarılarak iki anneye sahip olduğu düşünülebilecek bir hücre oluşturuldu. Yumurtalar daha sonra döllendi ve ortaya çıkan embriyonik kök hücreler, değiş tokuş edilen mitokondriyal DNA'yı taşıdı. Tekniğin güvenli olduğuna dair kanıt olarak, bu yöntemin yazarı, şu anda dört yaşından büyük olan ve farklı genetik geçmişlere sahip mitokondriyal nakillerin ürünü olan sağlıklı maymunların varlığına işaret ediyor.

Geç nesil telomeraz eksikliği olan (Terc-/-) farelerde, SCNT aracılı yeniden programlama, telomer işlev bozukluğunu ve mitokondriyal kusurları iPSC tabanlı yeniden programlamadan daha büyük ölçüde azaltır.

Diğer klonlama ve totipotent dönüşüm başarıları açıklanmıştır.

SCNT olmadan elde edildi

Son zamanlarda, bazı araştırmacılar SCNT'nin yardımı olmadan totipotent hücreler elde etmeyi başardılar. Totipotent hücreler, histonun oosit germinal izoformu gibi epigenetik faktörler kullanılarak elde edildi. Farelerde Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc dört faktörünün geçici indüksiyonuyla in vivo yeniden programlama, totipotens özellikleri kazandırır. Bu tür in vivo iPS hücrelerinin intraperitoneal enjeksiyonu, embriyonik ve ekstraembriyonik ( trofektodermal ) belirteçleri ifade eden embriyo benzeri yapılar oluşturur . Fare pluripotent kök hücrelerinin hem embriyonik hem de ekstra embriyonik soylar üretme potansiyeli , mikroRNA miR-34a eksikliği ile genişletilebilir ve bu da endojen retrovirüsler MuERV-L'nin (MERVL) güçlü indüksiyonuna yol açar .

iPSC'lerde gençleştirme

Pluripotent/embriyonik kök hücrelerin yetişkin memelilerin vücuduna transplantasyonu genellikle teratom oluşumuna yol açar , bu da daha sonra malign bir tümör teratokarsinomuna dönüşebilir. Bununla birlikte, teratokarsinom hücrelerinin blastosist aşamasında embriyoya yerleştirilmesi onların hücre kütlesine dahil olmasına neden oldu ve genellikle normal sağlıklı kimerik (yani farklı organizmalardan hücrelerden oluşan) bir hayvan üretti.

iPSc ilk olarak fare embriyolarından alınan greftlerin neden olduğu nakledilebilir teratokarsinom formunda elde edildi . Somatik hücrelerden oluşan teratokarsinom. Genetik olarak mozaik fareler , malign teratokarsinom hücrelerinden elde edildi ve hücrelerin pluripotensi doğrulandı. Teratokarsinom hücrelerinin , kültür ortamına çeşitli faktörler sağlayarak farklılaşmamış bir durumda pluripotent embriyonik kök hücre kültürünü muhafaza edebildiği ortaya çıktı . 1980'lerde, pluripotent/embriyonik kök hücrelerin yetişkin memelilerin vücuduna nakledilmesinin, genellikle teratomların oluşumuna yol açtığı ve bunun daha sonra malign bir tümör teratokarsinomuna dönüşebileceği netleşti. Bununla birlikte, teratokarsinom hücrelerinin blastosist aşamasında embriyoya yerleştirilmesi, onların iç hücre kütlesine dahil olmalarına neden oldu ve genellikle normal bir kimerik (yani farklı organizmalardan hücrelerden oluşan) bir hayvan üretti. Bu, teratomun nedeninin bir uyumsuzluk olduğunu gösterdi - genç donör hücreleri ile çevreleyen yetişkin hücreler (alıcının sözde " niş ") arasındaki karşılıklı yanlış iletişim .

Ağustos 2006'da, Japon araştırmacılar SCNT'de olduğu gibi bir oosit ihtiyacını ortadan kaldırdılar. Dört transkripsiyon faktörünün , yani Oct4 , Sox2 , Klf4 ve c-Myc'nin ektopik ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarını pluripotent kök hücrelere yeniden programlayarak , az sayıda faktörün aşırı ekspresyonunun hücreyi yeni bir kararlı duruma geçmeye itebileceğini kanıtladılar. binlerce genin aktivitesindeki değişikliklerle ilişkili durum.

İnsan somatik hücreleri, pluripotensi indükleyen faktörlerle (OCT 3/4, SOX2, Klf4, c-Myc, NANOG ve LIN28) dönüştürülerek pluripotent hale getirilir. Bu, üç embriyonik germ tabakasının (Mesoderm, Endoderm, Ectoderm) herhangi bir hücresine farklılaşabilen IPS hücrelerinin üretimi ile sonuçlanır.

Yeniden programlama mekanizmaları bu nedenle bağımsız değil, bağlantılıdır ve az sayıda gen üzerinde merkezlenir. IPSC özellikleri ESC'lere çok benzer. iPSC'lerin , gelişim potansiyeli için en katı tahlil olan bir tetraploid (4n) embriyo kullanarak tüm iPSC farelerinin gelişimini desteklediği gösterilmiştir . Bununla birlikte, bazı genetik olarak normal iPSC'ler, damgalanmış Dlk1-Dio3 gen kümesinin anormal epigenetik susturulması nedeniyle tamamen iPSC fareleri üretemedi . (1989'da Oct4 genini keşfeden) Hans Schöler tarafından yönetilen bir ekip, Oct4 aşırı ekspresyonunun, yeniden programlama sırasında iPSC'lerin kalitesini bozan büyük hedef dışı gen aktivasyonunu tetiklediğini gösterdi. Anormal damgalama ve farklılaşma modelleri gösteren OSKM (Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc) ile karşılaştırıldığında, SKM (Sox2, Klf4 ve c-Myc) yeniden programlama, yüksek gelişim potansiyeline sahip (OSKM'den yaklaşık 20 kat daha yüksek) iPSC'ler üretir. tetraploid embriyo tamamlama yoluyla tamamen iPSC fareleri üretme yetenekleriyle belirlendiği üzere embriyonik kök hücreye eşdeğerdir .

iPSC'nin ESC'ye göre önemli bir avantajı, embriyolardan ziyade yetişkin hücrelerden elde edilebilmeleridir. Bu nedenle yetişkin ve hatta yaşlı hastalardan iPSC elde etmek mümkün hale gelir.

Somatik hücrelerin iPSC'lere yeniden programlanması gençleşmeye yol açar. Yeniden programlamanın, telomerlerin fibroblast benzeri türevlere farklılaşmasından sonra telomer uzamasına ve ardından kısalmasına yol açtığı bulundu. Bu nedenle, yeniden programlama, embriyonik telomer uzunluğunun restorasyonuna yol açar ve bu nedenle, aksi takdirde Hayflick limitiyle sınırlı olan potansiyel hücre bölünme sayısını artırır .

Bununla birlikte, gençleşmiş hücreler ve alıcının eski hücrelerinin çevreleyen nişi arasındaki uyumsuzluk nedeniyle, kendi iPSC'sinin enjeksiyonu genellikle tıbbi amaçlar için kullanılabilen bir bağışıklık tepkisine veya teratom gibi tümörlerin oluşumuna yol açar . Varsayımlanan bir neden, in vivo olarak ESC'lerden ve iPSC'lerden farklılaşan bazı hücrelerin embriyonik protein izoformlarını sentezlemeye devam etmesidir . Bu nedenle, bağışıklık sistemi düzgün bir şekilde işbirliği yapmayan hücreleri algılayabilir ve onlara saldırabilir.

MitoBloCK-6 adı verilen küçük bir molekül , insan pluripotent kök hücrelerinde apoptozu tetikleyerek ( mitokondriyal dış zar boyunca sitokrom c salınımı yoluyla) pluripotent kök hücreleri ölmeye zorlayabilir , ancak farklılaşmış hücrelerde değil. Farklılaşmadan kısa bir süre sonra yavru hücreler ölüme karşı dirençli hale geldi. MitoBloCK-6, farklılaşmış hücre hatlarına tanıtıldığında, hücreler sağlıklı kaldı. Hayatta kalmalarının anahtarının, hücre farklılaşması sürecinde pluripotent kök hücre mitokondrilerinin geçirdiği değişikliklerden kaynaklandığı varsayıldı. MitoBloCK-6'nın pluripotent ve farklılaşmış hücre dizilerini ayırma yeteneği, rejeneratif tıpta teratom riskini ve diğer sorunları azaltma potansiyeline sahiptir.

2012 yılında, insan pluripotent kök hücrelerinin farelerde teratom oluşturmasını önleyen diğer küçük moleküller (insan pluripotent kök hücrelerinin seçici sitotoksik inhibitörleri - hPSC'ler) tanımlandı. Bunların en güçlü ve seçici bileşiği (PluriSIn #1), stearoyl-coA desatürazı ( oleik asit biyosentezindeki anahtar enzim ) inhibe eder ve bu da sonunda apoptoz ile sonuçlanır. Bu molekül yardımıyla farklılaşmamış hücreler seçici olarak kültürden uzaklaştırılabilir. Teratoma potansiyeli olan pluripotent hücreleri seçici olarak ortadan kaldırmak için etkili bir strateji, pluripotent kök hücreye özgü antiapoptotik faktör(ler)i (yani, survivin veya Bcl10) hedeflemektir. Kimyasal survivin inhibitörleri (örn., quercetin veya YM155) ile tek bir tedavi , farklılaşmamış hPSC'lerin seçici ve tam hücre ölümünü indükleyebilir ve transplantasyondan sonra teratom oluşumunu önlemek için yeterli olduğu iddia edilir. Ancak, herhangi bir ön iznin iPSC'lerin veya ESC'lerin yeniden yerleştirilmesini güvence altına alması pek olası değildir. Pluripotent hücrelerin seçici olarak çıkarılmasından sonra, farklılaşmış hücreleri kök hücrelere dönüştürerek hızla yeniden ortaya çıkarlar ve bu da tümörlere yol açar. Bu, mikro-RNA miRNA kaybını takiben yetişkin fibroblastlarda gen ekspresyonunu düzenleyen pluripotens genlerinin embriyonik bir transkripsiyonel baskılayıcısı olan hedef Nr6a1'in ( Germ hücre nükleer faktörü - GCNF olarak da bilinir) let-7 düzenlemesindeki bozukluktan kaynaklanabilir .

Pluripotent kök hücreler tarafından teratom oluşumu, farklılaşma sırasında yüksek oranda tümörijenik, agresif, teratom başlatan embriyonik benzeri karsinom hücrelerinin küçük bir popülasyonunun (toplam popülasyonun %0.1-5'i) hayatta kalmasını desteklediği bildirilen PTEN enziminin düşük aktivitesinden kaynaklanabilir. . Bu teratom başlatan hücrelerinin hayatta kalma başarısız bastırılmasından ile ilişkilidir Nanog yanı sıra artan glukoz ve kolesterol metabolizması için eğilimi. Bu teratom başlatan hücreler ayrıca, tümörijenik olmayan hücrelere kıyasla daha düşük bir p53/p21 oranı ifade etti. Yukarıdaki güvenlik problemleriyle bağlantılı olarak, hücre tedavisi için iPSC'lerin kullanımı hala sınırlıdır. Bununla birlikte, hastalığın modellenmesi, ilaçların taranması (seçici seçim) ve çeşitli ilaçların toksisite testleri dahil olmak üzere çeşitli başka amaçlar için kullanılabilirler.

Kök hücre kaderinin küçük molekül modülatörleri.

(Embriyolar yetişkin farelere büyüdü sonra) ve uygun fare gelişiminin erken evrelerinde "hayali" embriyolar yerleştirilen iPSCs dan yetişen doku, pratikte bir bağışıklık tepkisi neden yok otolog transplantasyonu , tam Aynı zamanda farelerde dört faktör Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc'nin geçici indüksiyonuyla dokular içinde yetişkin hücrelerin in vivo olarak yeniden programlanması, birden fazla organdan teratomların ortaya çıkmasına neden olur. Ayrıca, farelerde in vivo olarak hücrelerin pluripotense doğru kısmen yeniden programlanması, eksik yeniden programlamanın , kanser gelişimini yönlendiren hücrelerde epigenetik değişiklikler ( Polycomb hedeflerinin başarısız baskısı ve değiştirilmiş DNA metilasyonu ) gerektirdiğini gösterir . Bununla birlikte, bir dizi araştırmacı daha sonra , Yamanaka faktörlerinin kısa bir süre boyunca daha sonra karsinojenez olmadan ekspresyonu yoluyla döngüsel kısmi yeniden programlamayı in vivo gerçekleştirmeyi başardı , böylece progeroid farelerde kısmen gençleşti ve ömrünü uzattı. İle in vitro yöntem hücreleri geçici olarak hücre kimliğini kaybetmektedirler "yeniden programlama faktörleri çekildiği zaman başlangıç somatik kaderini yeniden almak" (büyük ölçüde yenilemek için) yeniden programlama biraz daha uzun süre kullanılması.

Bir protein yerine bir araç olarak küçük bir molekülün hücre kültürü örneği. olarak hücre kültürü , bir elde etmek üzere pankreas soyu arasından mezodermal kök hücre retinoik asit ise sinyal yolu aktive edilmelidir Sonic dikenli eklenerek yapılabilir yolu inhibe edilir, ortam anti-Shh antikorlar , Kirpi etkileşimli protein veya siklopamin - İlk ikisi protein, sonuncusu ise küçük bir moleküldür.

kimyasal teşvik

Deng Hongkui ve meslektaşları, yalnızca küçük moleküller kullanarak , hücre kaderinin yeniden programlanması için endojen "ana genlerin" yeterli olduğunu gösterdiler. Yedi küçük moleküllü bileşik kullanarak farelerin yetişkin hücrelerinde bir pluripotent durumu indüklediler. Yöntemin etkinliği oldukça yüksektir: yetişkin doku hücrelerinin %0.02'sini iPSC'lere dönüştürebildi, bu da gen ekleme dönüşüm oranıyla karşılaştırılabilir. Yazarlar, CiPSC'lerden üretilen farelerin "6 aya kadar %100 canlı ve görünüşte sağlıklı" olduğunu belirtiyorlar. Bu nedenle, bu kimyasal yeniden programlama stratejisi, klinik uygulamalar için fonksiyonel istenen hücre tiplerinin üretilmesinde potansiyel kullanıma sahiptir.

2015 yılında, daha önce bildirilen protokolden 1.000 kat daha fazla verimle sağlam bir kimyasal yeniden programlama sistemi kuruldu. Böylece, kimyasal yeniden programlama, hücre kaderlerini manipüle etmek için umut verici bir yaklaşım haline geldi.

İndüklenmiş teratomdan farklılaşma

İnsan iPSC'lerinin sadece insanlarda değil, aynı zamanda bazı hayvan vücudunda, özellikle farelerde veya domuzlarda teratom oluşturabilmesi, araştırmacıların iPSC'lerin in vivo farklılaşması için bir yöntem geliştirmesine izin verdi. Bu amaçla, hedef hücrelerde farklılaşmayı indüklemek için bir ajana sahip iPSC'ler , insan hücreleri üzerinde bağışıklık sistemi aktivasyonunu baskılayan genetiği değiştirilmiş bir domuz veya fareye enjekte edilir . Oluşan teratom kesilir ve bu hücrelerin yüzeyindeki dokuya özgü belirteçlere monoklonal antikor vasıtasıyla gerekli farklılaşmış insan hücrelerinin izolasyonu için kullanılır . Bu yöntem, transplantasyona uygun fonksiyonel miyeloid, eritroid ve lenfoid insan hücrelerinin üretimi için başarıyla kullanılmıştır (henüz sadece farelere). İnsan iPSC teratomdan türetilen hematopoietik hücrelerle aşılanmış fareler, fonksiyonel bağışıklık tepkileri verebilen insan B ve T hücrelerini üretti. Bu sonuçlar, transplantasyon, insan antikor üretimi ve ilaç tarama uygulamaları için yararlı olabilecek materyaller sağlayarak hastaya özel hücrelerin in vivo üretiminin mümkün olduğunu ummaktadır. MitoBloCK-6 ve/veya PluriSIn # 1 kullanılarak farklılaştırılmış progenitör hücreler, pluripotent hücreler oluşturan teratomdan daha fazla saflaştırılabilir. Farklılaşmanın teratoma nişinde bile gerçekleşmesi gerçeği, ortaya çıkan hücrelerin farklılaşmamış (pluripotent) duruma geri geçişlerine neden olabilecek uyaranlara karşı yeterince kararlı ve bu nedenle güvenli olduğu umudunu sunar. Suzuki ve ark. iPSC'den türetilen hematopoietik kök hücrelerin ışınlanmış alıcılara intravenöz enjeksiyonundan sonra alıcılarda ne lösemi ne de tümör gözlenmediğini belirtmişlerdir. Ayrıca, bu enjeksiyon, seri transferlerde hematolenfopoietik sistemin çok soylu ve uzun süreli yeniden yapılandırılmasıyla sonuçlandı. Böyle bir sistem, hematolojik ve immünolojik hastalıkların tedavisinde iPSC'lerin pratik uygulaması için yararlı bir araç sağlar.

Bu yöntemin daha da geliştirilmesi için, insan hücre aşısının büyütüldüğü hayvanlar (fareler gibi), tüm hücrelerinin eksprese ettiği ve yüzeyinde insan SIRPa'ya sahip olduğu şekilde değiştirilmiş genoma sahip olmalıdır . Hayvanda in vivo, pluripotent kök hücreleri büyüdü alojenik organ veya doku, bir hastaya transplantasyon sonrası reddedilmesini önlemek için, bu hücrelerin, iki molekülleri ifade olmalıdır: CTLA4-lg , T hücresi eş uyarıcı yollar ve bozan, PD-L1 , burada T hücre inhibitör yolunu aktive eder.

Ayrıca bakınız: ABD 20130058900  patenti.

Farklılaşmış hücre tipleri

retina hücreleri

Yakın gelecekte, retinaya zarar vererek körlüğe neden olan bir hastalık olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu olan kişilerin hücre tedavisi için iPSC kullanımının güvenliğini göstermek için tasarlanmış klinik deneyler başlayacak. iPSC'lerden retina hücreleri üretme yöntemlerini ve bunların hücre tedavisi için nasıl kullanılacağını açıklayan birkaç makale vardır. iPSC'den türetilen retinal pigmentli epitel transplantasyonu raporları, transplantasyondan sonraki 6 hafta boyunca deney hayvanlarının görsel yönlendirmeli davranışlarının arttığını göstermiştir. Bununla birlikte, klinik deneyler başarılı olmuştur: retinitis pigmentosa'dan muzdarip on hasta, görme yetisinin yalnızca yüzde 17'si kalan bir kadın da dahil olmak üzere, görme yetisine kavuşmuştur.

Akciğer ve hava yolu epitel hücreleri

İdiyopatik pulmoner fibroz ve kistik fibroz veya kronik obstrüktif akciğer hastalığı ve astım gibi kronik akciğer hastalıkları, önemli bir insani, toplumsal ve finansal yük ile dünya çapında önde gelen morbidite ve mortalite nedenleridir. Bu nedenle, etkili hücre tedavisine ve akciğer dokusu mühendisliğine acilen ihtiyaç vardır . Hastaya özgü terapötik hücrelerin türetilmesi için yararlı olabilecek solunum sisteminin çoğu hücre tipinin üretilmesi için çeşitli protokoller geliştirilmiştir .

üreme hücreleri

Bazı iPSC dizileri, uygun bir niş içinde erkek germ hücreleri ve oosit benzeri hücrelere farklılaşma potansiyeline sahiptir (retinoik asit ve domuz foliküler sıvı farklılaşma ortamında veya seminifer tübül transplantasyonunda kültürlenerek). Ayrıca, iPSC transplantasyonu, infertil farelerin testislerinin onarılmasına katkıda bulunur ve in vivo ve in vitro olarak iPSC'lerden gamet türetme potansiyelini gösterir.

Uyarılmış progenitör kök hücreler

Doğrudan farklılaşma

Kanser ve tümör riski, klinik kullanıma uygun daha güvenli hücre dizileri için yöntemler geliştirme ihtiyacını doğurmaktadır. Alternatif bir yaklaşım, "doğrudan yeniden programlama" olarak adlandırılır - hücrelerin pluripotent durumdan geçmeden farklılaşması. Bu yaklaşımın temeli, bir DNA demetilasyon reaktifi olan 5-azasitidinin , ölümsüz bir fare embriyonik fibroblast hücre dizisinde miyojenik , kondrojenik ve adipogeni klonların oluşumuna neden olabilmesi ve daha sonra MyoD1 olarak adlandırılan tek bir genin aktivasyonunun olmasıydı. böyle bir yeniden programlama için yeterlidir. Yeniden programlaması en az iki hafta gerektiren iPSC'lerle karşılaştırıldığında, indüklenmiş progenitör hücrelerin oluşumu bazen birkaç gün içinde gerçekleşir ve yeniden programlamanın verimliliği genellikle birçok kat daha yüksektir. Bu yeniden programlama her zaman hücre bölünmesini gerektirmez. Bu yeniden programlama sonucu oluşan hücreler teratom oluşturmadıkları için hücre tedavisi için daha uygundur. Örneğin, Chandrakanthan ve diğerleri, & Pimanda, olgun kemik ve yağ hücrelerini bir büyüme faktörü ile geçici olarak tedavi ederek doku rejeneratif multipotent kök hücrelerin (iMS hücreleri) oluşumunu açıklar ( trombosit türevli büyüme faktörü –AB (PDGF-AB)) ve 5-Azasitidin. Bu yazarlar, "Klinik uygulamada doku onarımını teşvik etmek için çok az nesnel kanıtla kullanılan birincil mezenkimal kök hücrelerin aksine, iMS hücrelerinin tümör oluşturmadan içeriğe bağlı bir şekilde doğrudan in vivo doku rejenerasyonuna katkıda bulunduğunu" ve bu nedenle "önemli ölçüde önemli olduğunu" belirtiyorlar. doku rejenerasyonunda uygulama kapsamı".

Tek transkripsiyon faktörü transdiferansiasyonu

Başlangıçta, yalnızca erken embriyonik hücreler kimliklerini değiştirmeye ikna edilebilirdi. Olgun hücreler, belirli bir türe bağlandıklarında kimliklerini değiştirmeye karşı dirençlidir. Bununla birlikte, tek bir transkripsiyon faktörünün, ELT-7 GATA faktörünün kısa ifadesi, farenksin tamamen farklılaşmış, özelleşmiş endodermal olmayan hücrelerinin kimliğini, bozulmamış larvalarda ve yetişkin yuvarlak solucan Caenorhabditis elegans'ta tamamen farklılaşmış bağırsak hücrelerine dönüştürebilir . farklılaşmamış bir ara madde.

CRISPR aracılı aktivatör ile farklılaşma

Hücre kaderi, özellikle CRISPR aracılı aktivatör ile spesifik endojen gen ekspresyonunun doğrudan aktivasyonu yoluyla, epigenom düzenleme ile etkili bir şekilde manipüle edilebilir . Tüm dCas9 (artık DNA keser, ama yine de spesifik sekanslar ve onlara bağlama yönlendirilir, böylece tadil edilmiş olan) transkripsiyon aktivatörleri ile birleştirilir, bu kesin olarak endojen gen ekspresyonu işlemek olabilir. Bu yöntemi kullanarak, Wei ve diğerleri, CRISPR aracılı aktivatörler tarafından endojen Cdx2 ve Gata6 genlerinin ekspresyonunu arttırdı , böylece fare embriyonik kök hücrelerini doğrudan iki ekstraembriyonik soy, yani tipik trofoblast kök hücreleri ve ekstraembriyonik endoderm hücrelere dönüştürdü. Fare embriyonik fibroblastlarını indüklenmiş nöronal hücrelere dönüştürmek için endojen Brn2, Ascl1 ve Myt1l genlerinin aktivasyonunu indüklemek için benzer bir yaklaşım kullanıldı. Bu nedenle, endojen ana transkripsiyon faktörlerinin transkripsiyonel aktivasyonu ve epigenetik yeniden modellenmesi, hücre tipleri arasında dönüşüm için yeterlidir. Bu yaklaşımla endojen genlerin doğal kromatin bağlamında hızlı ve sürekli aktivasyonu, genomik entegrasyondan kaçınan geçici yöntemlerle yeniden programlamayı kolaylaştırabilir ve hücre kaderi spesifikasyonuna epigenetik engellerin üstesinden gelmek için yeni bir strateji sağlar.

Aşamalı süreç modelleme rejenerasyonu

Yeniden programlamanın başka bir yolu, amfibi uzuv rejenerasyonu sırasında meydana gelen süreçlerin simülasyonudur . Gelen urodele amfibiler, bacak rejenerasyon bir erken adımdır iskelet kas lifi Farklılaşması bir cellulate içine olduğu bacak dokusuna çoğalmakta. Bununla birlikte, kas lifinin miyoseverin, reversin ( aurora B kinaz inhibitörü) ve diğer bazı kimyasallarla (BIO (glikojen sentaz-3 kinaz inhibitörü), lisofosfatidik asit (G-protein-bağlı reseptörlerin pleiotropik aktivatörü ) ile sıralı küçük molekül tedavisi , SB203580 ( p38 MAP kinaz inhibitörü) veya SQ22536 ( adenilil siklaz inhibitörü) yeni kas hücresi tiplerinin yanı sıra yağ, kemik ve sinir sistemi hücrelerinin öncüleri gibi diğer hücre tiplerinin oluşumuna neden olur.

Antikor bazlı transdiferansiyasyon

Araştırmacılar keşfettik GCSF -mimicking antikor üzerinde bir büyümeyi uyarıcı reseptörü aktive olabilir iliği indükler normal sinir progenitör hücreler haline beyaz kan hücreleri haline kök hücreler kemik iliğini bir şekilde hücreler. Teknik, araştırmacıların geniş antikor kütüphanelerini aramasına ve istenen biyolojik etkiye sahip olanları hızla seçmesine olanak tanır.

Bakteriler tarafından yeniden programlama

İnsan gastrointestinal sistemi, geniş bir ortakyaşar ve ortak yaşam topluluğu tarafından kolonize edilmiştir. Araştırmacılar, bakteriler tarafından somatik hücrenin yeniden programlanması olgusunu ve yetişkin insan dermal fibroblast hücrelerinden Laktik asit bakterilerini dahil ederek çok potansiyelli hücrelerin üretilmesi olgusunu ortaya koyuyorlar. ribozomal stresi indükleyebilir ve hücresel gelişimsel plastisiteyi uyarabilir".

Koşullu olarak yeniden programlanmış hücreler

Schlegel ve Liu, besleyici hücreler ve bir Rho kinaz inhibitörü (Y-27632) kombinasyonunun, in vitro olarak süresiz olarak çoğalmak için birçok dokudan normal ve tümör epitel hücrelerini indüklediğini gösterdi. Bu süreç, ekzojen viral veya hücresel genlerin transdüksiyonuna ihtiyaç duymadan gerçekleşir. Bu hücreler "Koşullu Olarak Yeniden Programlanmış Hücreler (CRC)" olarak adlandırılmıştır. CRC'lerin uyarılması hızlıdır ve tüm hücre popülasyonunun yeniden programlanmasından kaynaklanır. CRC'ler, iPSC'lerin veya embriyonik kök hücrelerin (ESC'ler) (örn., Sox2, Oct4, Nanog veya Klf4) karakteristiği olan yüksek protein seviyelerini ifade etmez. CRC'lerin bu indüksiyonu tersine çevrilebilir ve Y-27632'nin ve besleyicilerin çıkarılması, hücrelerin normal şekilde farklılaşmasına izin verir. CRC teknolojisi 2 üretebilir x 10 ⁶ iğne biyopsilerinden 5 ila 6 gün hücrelerin ve dondurularak saklanmış dokudan ve dörtten az canlı hücre kültürleri üretir. CRC'ler normal bir karyotipi korur ve tümörijenik olmayan kalır. Bu teknik aynı zamanda insan ve kemirgen tümörlerinden hücre kültürlerini verimli bir şekilde oluşturur.

Küçük biyopsi örneklerinden ve donmuş dokudan hızlı bir şekilde birçok tümör hücresi üretme yeteneği, hücre bazlı teşhis ve terapötikler (kemosensitivite testi dahil) için önemli fırsatlar sağlar ve biyo-bankacılığın değerini büyük ölçüde artırır. Araştırmacılar, CRC teknolojisini kullanarak, nadir görülen bir akciğer tümörü tipine sahip bir hasta için etkili bir tedavi belirleyebildiler. Engleman'ın grubu, CRC sistemini kullanarak direncin üstesinden gelebilecek ilaç kombinasyonlarının hızlı keşfini kolaylaştıran bir farmakogenomik platform tanımlamaktadır. Ek olarak, CRC yöntemi, epitel hücrelerinin ex vivo genetik manipülasyonuna ve bunların aynı konakta in vivo olarak sonraki değerlendirilmesine izin verir. İlk çalışmalar, epitel hücrelerinin İsviçre 3T3 hücreleri J2 ile birlikte kültürlenmesinin CRC indüksiyonu için gerekli olduğunu ortaya çıkarsa da, transwell kültür plakaları ile besleyiciler ve epitel hücreleri arasında fiziksel temas, CRC'leri indüklemek ve daha da önemlisi besleyici hücrelerin ışınlanması için gerekli değildir. bu indüksiyon için gereklidir. Transwell deneyleriyle uyumlu olarak, şartlandırılmış ortam, hücresel telomeraz aktivitesinin eşzamanlı bir artışının eşlik ettiği CRC'leri indükler ve korur. Koşullu ortamın aktivitesi, radyasyona bağlı besleyici hücre apoptozu ile doğrudan ilişkilidir. Bu nedenle, epitel hücrelerinin koşullu yeniden programlanmasına, Y-27632 ve apoptotik besleyici hücreler tarafından salınan çözünür faktör(ler)in bir kombinasyonu aracılık eder.

Riegel et al. normal meme bezlerinden veya fare meme tümörü virüsü (MMTV)-Neu kaynaklı meme tümörlerinden izole edilen fare ME hücrelerinin, koşullu olarak yeniden programlanmış hücreler (CRC'ler) olarak süresiz olarak kültürlenebileceğini gösterir. Hücre yüzeyi progenitörle ilişkili belirteçler, ME hücrelerine göre normal fare ME-CRC'lerinde hızla indüklenir. Bununla birlikte, CD49f+ ESA+ CD44+ gibi belirli meme progenitör alt popülasyonlarının ifadesi sonraki pasajlarda önemli ölçüde düşer. Bununla birlikte, üç boyutlu bir hücre dışı matris içinde büyütülen fare ME-CRC'leri, meme asiner yapılarına yol açmıştır. MMTV-Neu transgenik fare meme tümörlerinden izole edilen ME-CRC'ler, yüksek seviyelerde HER2/neu ve ayrıca CD44+, CD49f+ ve ESA+ (EpCam) gibi tümör başlatıcı hücre belirteçlerini ifade eder. Bu ifade kalıpları daha sonraki CRC pasajlarında sürdürülür. Sengeneik veya çıplak farelerin meme yağ yastıklarına implante edilen MMTV-Neu tümörlerinden erken ve geç geçiş ME-CRC'leri, transplantasyonun 6 haftası içinde metastaz yapan vasküler tümörler geliştirdi. Önemli olarak, bu tümörlerin histopatolojisi, MMTV-Neu farelerinde gelişen ebeveyn tümörlerinden ayırt edilemezdi. CRC sisteminin fare meme epitel hücrelerine uygulanması, tanımlanmış bir kültür ortamında ve in vivo transplant çalışmalarında normal ve dönüştürülmüş fare epitelinin genetiği ve fenotipini incelemek için çekici bir model sistem sağlar.

CRC'ye farklı bir yaklaşım , trombospondin-1 reseptörü olan bir zar proteini olan CD47'yi inhibe etmektir . CD47'nin kaybı, birincil murin endotel hücrelerinin sürekli çoğalmasına izin verir , asimetrik bölünmeyi arttırır ve bu hücrelerin çok noktalı embriyoid vücut benzeri kümeler oluşturmak için kendiliğinden yeniden programlanmasını sağlar . CD47 yıkımı , hücrelerde in vitro ve in vivo olarak c-Myc ve diğer kök hücre transkripsiyon faktörlerinin mRNA seviyelerini akut olarak artırır . Trombospondin-1, CD47 aracılığıyla kök hücrenin kendini yenilemesini engelleyen önemli bir çevresel sinyaldir. Böylece, CD47 antagonistleri, c-Myc ve diğer kök hücre transkripsiyon faktörlerinin negatif düzenlenmesinin üstesinden gelerek hücrenin kendini yenilemesini ve yeniden programlanmasını sağlar. Bir antisens morfolino kullanılarak CD47'nin in vivo blokajı, kemik iliğinden türetilen hücrelerin artan çoğalma kapasitesi ve radyo-duyarlı gastrointestinal dokuların radyo-koruması nedeniyle öldürücü toplam vücut radyasyonuna maruz kalan farelerin hayatta kalmasını arttırır.

Nesle özgü geliştiriciler

Farklılaşmış makrofajlar dokularda kendini yenileyebilir ve kültürde uzun vadede genişleyebilir. Belirli koşullar altında makrofajlar, bağışıklık hücrelerinde uzmanlaşırken kazandıkları özellikleri kaybetmeden bölünebilirler - bu genellikle farklılaşmış hücrelerde mümkün değildir . Makrofajlar bunu , embriyonik kök hücrelerde bulunana benzer bir gen ağını aktive ederek başarır. Tek hücreli analiz , in vivo olarak çoğalan makrofajların, kendi kendini yenilemeyi kontrol eden bir gen ağı ile bağlantılı makrofaj-spesifik güçlendirici repertuarını baskılayabildiğini ortaya çıkardı . Bu, MafB ve c- Maf adlı iki transkripsiyon faktörünün konsantrasyonları doğal olarak düşük olduğunda veya kısa bir süre için engellendiğinde meydana geldi. Makrofajlarda MafB ve c-Maf'i kapatan genetik manipülasyonlar, hücrelerin kendi kendini yenileme programını başlatmasına neden oldu. Benzer ağ aynı zamanda embriyonik kök hücrenin kendi kendini yenilemesini de kontrol eder, ancak farklı embriyonik kök hücreye özgü güçlendiricilerle ilişkilidir.

Dolayısıyla MafB- ve c-Maf-çift eksikliği olan farelerden izole edilen makrofajlar süresiz olarak bölünür; kendini yenileme c-Myc ve Klf4'e bağlıdır .

Dolaylı soy dönüştürme

Dolaylı soy dönüşümü, somatik hücrelerin, kısmen yeniden programlanmış hücrelerin (iPSC öncesi) plastik bir ara durumundan geçtiği, yeniden programlama faktörlerine kısa süreli maruz kalmanın neden olduğu ve ardından özel olarak geliştirilmiş bir kimyasal ortamda (yapay niş) farklılaştığı bir yeniden programlama metodolojisidir.

Bu yöntem, tümörler veya diğer istenmeyen genetik değişiklikler üretmediği ve diğer yöntemlerden çok daha fazla verim sağladığı için hem daha verimli hem de daha güvenli olabilir. Bununla birlikte, bu hücrelerin güvenliği tartışmalıdır. Ön iPSC'den soy dönüşümü, iPSC yeniden programlama koşullarının kullanımına dayandığından, hücrelerin bir kısmı, farklılaşma sürecini in vitro olarak durdurmazlarsa veya in vivo olarak daha fazla farklılaşmadan dolayı pluripotent özellikler kazanabilir.

Dış zar glikoproteini

Pluripotent kök hücrelerin ortak bir özelliği, dış zarlarının protein glikozilasyonunun spesifik doğasıdır . Bu, onları beyaz kan hücrelerinden olmasa da pluripotent olmayan hücrelerin çoğundan ayırır . Glukanlardır hızla hücresel devlet ve sinyalizasyon ve değişikliklere kök hücre yüzey yanıt verdiğini bu nedenle hücre popülasyonlarının bile küçük değişiklikler tanımlamak için idealdir. Birçok kök hücre markörü , yaygın olarak kullanılan markörler SSEA-3 , SSEA-4, Tra 1-60 ve Tra 1-81 dahil olmak üzere hücre yüzeyi glikan epitoplarına dayanmaktadır . Suila Heli et al. insan kök hücrelerinde, hücre dışı O-GlcNAc ve hücre dışı O-LacNAc'ın Notch sinyal yolunun ince ayarında çok önemli bir rol oynadığını tahmin edin - hücre kaderi spesifikasyonunu, farklılaşmayı, sol-sağ asimetriyi, apoptozu düzenleyen yüksek oranda korunmuş bir hücre sinyal sistemi, somitogenez ve anjiyogenez ve kök hücre proliferasyonunda önemli bir rol oynar (Perdigoto ve Bardin ve Jafar-Nejad ve diğerleri tarafından gözden geçirilmiştir.)

Dış zar protein glikosilasyonundaki değişiklikler, bir şekilde pluripotens ve farklılaşma ile bağlantılı hücre durumlarının belirteçleridir. Glikozilasyon değişikliği, görünüşe göre sadece gen ekspresyonunun başlatılmasının sonucu değil, aynı zamanda farklılaşmamış durumun elde edilmesi ve sürdürülmesinde yer alan önemli bir gen düzenleyicisi olarak da işlev görür.

Örneğin, insan periferik kanındaki progenitör hücrelerin yüzeyindeki glikosilfosfatidilinositolü bağlayan glikoprotein ACA'nın aktivasyonu , bir sinyal kaskad PI3K / Akt / mTor / PTEN aracılığıyla Wnt , Notch-1 , BMI1 ve HOXB4 genlerinin ekspresyonunun artmasına neden olur ve oluşumunu destekler. kendini yenileyen bir hematopoietik kök hücre popülasyonu.

Ayrıca, ACA'ya bağlı sinyal yolu tarafından indüklenen progenitör hücrelerin farklılaşması, in vitro olarak her üç germ tabakasının hücrelerine farklılaşabilen ACA kaynaklı pluripotent kök hücrelere yol açar . Lektinlerin bir pluripotent insan kök hücresi kültürünü sürdürme yeteneğinin araştırılması, insan pluripotent kök hücrelerinin yetiştirilmesi için basit ve oldukça etkili bir matris olarak hizmet edebilen lektin Erythrina crista-galli'nin (ECA) keşfedilmesine yol açmıştır .

Proteoglikan ile yeniden programlama

Somatik hücreleri pluripotent durumlara dönüştürmek için alternatif bir strateji, tek bir ECM proteoglikan olan fibromodulin tarafından fibroblastların sürekli uyarılması olabilir . Bu tür hücreler, iPSC'lere kıyasla belirgin şekilde daha düşük tümörijenik risk ile iskelet kası rejenerasyonu için yetenek sergiler. Bu tür hücrelerin azalmış tümörijenitesi, rekombinant insan fibromodulin yeniden programlama işlemi sırasında CDKN2B yukarı regülasyonu ile ilgilidir.

Fiziksel bir yaklaşımla yeniden programlama

Hücre yapışma proteini E-cadherin , sağlam bir pluripotent fenotip için vazgeçilmezdir . iPS hücre üretimi için yeniden programlama sırasında, N-cadherin , E-cadherin işlevinin yerini alabilir. Kadherinlerin bu işlevleri doğrudan yapışma ile ilgili değildir, çünkü küre morfolojisi kök hücrelerin "köklülüğünü" korumaya yardımcı olur. Ayrıca, düşük bağlanma yüzeyinde hücrelerin zorla büyümesi nedeniyle küre oluşumu, bazen yeniden programlamaya neden olur. Örneğin, nöral progenitör hücreler, eksojen yeniden programlama faktörleri dahil edilmeden doğrudan fiziksel bir yaklaşımla fibroblastlardan üretilebilir.

Hücre yapışkanlı substratların yüzeyinde paralel mikro oluklar şeklindeki fiziksel ipuçları, küçük moleküllü epigenetik değiştiricilerin etkilerinin yerini alabilir ve yeniden programlama verimliliğini önemli ölçüde artırabilir. Mekanizma, hücrelerin epigenetik durumunun mekanik modülasyonuna dayanır. Spesifik olarak, "düşük histon deasetilaz aktivitesi ve WD tekrar alanı 5 (WDR5) - H3 metiltransferazın bir alt birimi - ifadesinin mikro-yivli yüzeyler tarafından yukarı regülasyonu, artan histon H3 asetilasyonu ve metilasyonuna yol açar". Hizalanmış lif yönelimli nano lifli yapı iskeleleri, mikro oluklar tarafından üretilenlere benzer etkiler üretir, bu da hücre morfolojisindeki değişikliklerin epigenetik durumun modülasyonundan sorumlu olabileceğini düşündürür.

Nöral gelişimde hücre adezyonlarının rolü . GNU Özgür Belgeleme Lisansı kapsamında Wikipedia kullanıcısı JWSchmidt'in izniyle

Substrat sertliği, nöral indüksiyonu ve alt tip spesifikasyonunu etkileyen önemli bir biyofiziksel ipucudur. Örneğin, yumuşak substratlar, BMP4'e bağlı bir şekilde hESC'lerin nöral krest farklılaşmasını inhibe ederken nöroepitelyal dönüşümü destekler . Mekanistik çalışmalar, mekanik duyarlı Smad fosforilasyonu ve nükleositoplazmik mekik içeren , sertliğe bağlı Hippo / YAP aktiviteleri ve aktomiozin hücre iskeleti bütünlüğü ve kontraktilitesi ile düzenlenen çok hedefli bir mekanik transdüktif süreci ortaya çıkardı .

Fare embriyonik kök hücreleri (mESC'ler), sitokin lösemi önleyici faktör (LIF) varlığında kendi kendini yenilemeye tabi tutulur . LIF çekilmesinin ardından, mESC'ler hücre-alt tabaka yapışmasında ve hücre yayılmasında bir artışla birlikte farklılaşır . Kimyasal olarak tanımlanmış, zayıf yapışkan biyosubstratlar üzerinde mESC'leri kültürleyerek veya hücre iskeletini manipüle ederek LIF yokluğunda sınırlı hücre yayılması , hücrelerin farklılaşmamış ve pluripotent bir durumda kalmasına izin verdi. Sınırlı hücre yayılmasının mESC kendini yenileme üzerindeki etkisine, artan hücreler arası yapışma aracılık etmez, çünkü bir fonksiyon bloke eden anti E-kadherin antikoru veya siRNA kullanılarak mESC yapışmasının inhibisyonu farklılaşmayı desteklemez. Hücre dışı matris ile fiziksel etkileşimler yoluyla kök hücre kaderinin önceden belirlenmesinin olası mekanizmaları tarif edilmiştir.

3D mikro-ortam sertliği ve çevreleyen jelin yoğunluğu kullanılarak hücreleri 'sıkıştırarak' hücreleri daha hızlı ve daha verimli bir şekilde kök hücrelere dönüştüren yeni bir yöntem geliştirildi. Teknik, endüstriyel ölçekte tıbbi amaçlar için kök hücre üretmek için çok sayıda hücreye uygulanabilir.

Yeniden programlama sürecine dahil olan hücreler, süreç ilerledikçe morfolojik olarak değişir. Bu, hücreler arasındaki yapışma kuvvetlerinde fiziksel farklılıklara neden olur. Pluripotent kök hücreler, kısmen yeniden programlanmış hücreler, farklılaştırılmış soy ve somatik hücreler arasındaki 'yapışkan imza'daki önemli farklılıklar, mikroakışkan cihazlarda pluripotent kök hücrelerin izolasyonu için ayırma işleminin geliştirilmesine izin verdi :

1. hızlı (ayırma 10 dakikadan az sürer);
2. verimli (ayırma, yüzde 95'ten fazla saf iPS hücre kültürüyle sonuçlanır);
3. zararsızdır (hücre hayatta kalma oranı yüzde 80'den fazladır ve ortaya çıkan hücreler normal transkripsiyonel profilleri, farklılaşma potansiyelini ve karyotipi korur).

Kök hücreler mekanik belleğe sahiptir (geçmiş fiziksel sinyalleri hatırlarlar) - Hippo sinyal yolu faktörleriyle birlikte: Yes ile ilişkili protein (YAP) ve PDZ-bağlanma alanı (TAZ) ile transkripsiyonel koaktivatör , hücre içi mekanik reostat olarak işlev görür - geçmişten gelen bilgileri depolar fiziksel ortamlar ve hücrelerin kaderini etkiler.

sinir kök hücreleri

Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı ve amyotrofik lateral skleroz gibi felç ve birçok nörodejeneratif bozukluk, hücre replasman tedavilerine ihtiyaç duyar. Transplantasyonlarda dönüştürülmüş nöral hücrelerin (cN'ler) başarılı kullanımı, bu tür hastalıkları tedavi etmek için yeni bir yol açar. Bununla birlikte, doğrudan fibroblastlardan dönüştürülen uyarılmış nöronlar (iN'ler) terminal olarak bağlanır ve transplantasyon için yeterli otolog donör hücre sağlayamayan çok sınırlı proliferatif yetenek sergiler . Kendi kendini yenileyen nöral kök hücreler (iNSC'ler), hem temel araştırma hem de klinik uygulamalar için iN'lere göre ek avantajlar sağlar.

Örneğin, belirli büyüme koşulları altında, fare fibroblastları, kültürde ve transplantasyondan sonra kendi kendini yenileyen ve fare beyinlerinde tümör oluşturmadan hayatta kalabilen ve entegre olabilen iNSC'ler oluşturmak üzere tek bir faktör olan Sox2 ile yeniden programlanabilir. INSC'ler, viral olmayan tekniklerle yetişkin insan fibroblastlarından türetilebilir, böylece otolog transplantasyon veya hücre bazlı hastalık modellerinin geliştirilmesi için güvenli bir yöntem sunar.

Nöral kimyasal olarak indüklenen progenitör hücreler (ciNPC'ler), fare kuyruk ucu fibroblastlarından ve insan üriner somatik hücrelerinden, eksojen faktörler eklenmeden, ancak - kimyasal bir kokteylle, yani VCR (V, VPA , bir HDAC inhibitörü ; C, CHIR99021 ile) üretilebilir. bir GSK-3 kinaz inhibitörü ve R, RepSox , bir inhibitörü TGF beta, sinyal yollarında bir fizyolojik altında), hipoksik durumun . Histon deasetilasyonu, glikojen sentaz kinaz ve TGF-β yolakları inhibitörlerine sahip alternatif kokteyller (burada: sodyum bütirat (NaB) veya Trichostatin A (TSA), VPA, Lityum klorür (LiCl) veya lityum karbonatın (Li2CO3) yerini alabilir, CHIR99021 veya Repsox, SB-431542 veya Tranilast ile değiştirilebilir ) ciNPC indüksiyonu için benzer etkiler gösterir. Zhang ve diğerleri, ayrıca, fare fibroblastlarının, dokuz bileşenli bir kokteyl kullanılarak indüklenmiş nöral kök hücre benzeri hücrelere (ciNSLC'ler) yüksek verimli bir şekilde yeniden programlandığını da bildirmektedir.

Somatik hücrelerin uyarılmış nöral kök hücrelere doğrudan transformasyonunun birçok yöntemi tarif edilmiştir.

İlke deneylerinin kanıtı, yeniden programlanan genler ( Ascl1 , Brn2a ve Myt1l ) transplantasyondan sonra aktive edildiğinde, nöral yeniden programlama genlerinin indüklenebilir formlarını ifade etmek üzere tasarlanmış olan nakledilen insan fibroblastlarını ve insan astrositlerini doğrudan beyinde nöronlara dönüştürmenin mümkün olduğunu göstermektedir. bir ilaç kullanmak.

Astrositler - en yaygın nöroglial katkı beyin hücreleri, yara yaralanmaya yanıt olarak oluşumu - doğrudan doğruya fonksiyonel nöron olmak için in vivo olarak yeniden programlanabilir, hücre transplantasyonu için ihtiyaç olmayan farelerde şebekeler. Araştırmacılar, tümör oluşumu belirtileri aramak için fareleri yaklaşık bir yıl boyunca takip ettiler ve hiçbirini bulamadıklarını bildirdiler. Aynı araştırmacılar, yara oluşturan astrositleri, yaralı yetişkin omuriliğinde nöronlara dönüşen nöroblast adı verilen progenitör hücrelere dönüştürdüler.

Oligodendrosit öncü hücreleri

Nöronları izole edecek miyelin olmadan , sinir sinyalleri hızla güç kaybeder. Multipl skleroz gibi miyeline saldıran hastalıklar, sinir uçlarına yayılamayan sinir sinyalleriyle sonuçlanır ve bunun sonucunda bilişsel, motor ve duyusal sorunlara yol açar. Sinir hücrelerinin çevresinde başarılı bir şekilde miyelin kılıfları oluşturabilen oligodendrosit öncü hücrelerinin (OPC'ler) transplantasyonu umut verici bir potansiyel terapötik yanıttır. Fare ve sıçan fibroblastlarının oligodendroglial hücrelere doğrudan soy dönüşümü, potansiyel bir OPC kaynağı sağlar. Hem sekizinin hem de üç transkripsiyon faktörünün Sox10, Olig2 ve Zfp536'nın zorla ekspresyonu yoluyla dönüştürülmesi, bu tür hücreleri sağlayabilir.

kardiyomiyositler

Hücre bazlı in vivo terapiler, vasküler ve kas büyümesini artırmak ve kalbe transkripsiyon faktörleri veya mikroRNA'lar ileterek kontraktil olmayan skar oluşumunu önlemek için dönüştürücü bir yaklaşım sağlayabilir. Memeli merkezinde hücrelerin% 50'sini temsil eden kardiyak fibroblastlar, içine yeniden olabilir kardiyomiyosit kardiyak çekirdek transkripsiyon faktörlerinin (GATA4, MEF2C Tbx5 lokal sağlanması ile ve geliştirilmiş yeniden programlama artı ESRRG, MESP1, Myocardin ve in vivo hücre benzeri ZFPM2) koroner ligasyondan sonra . Bu sonuçlar, hücre nakli olmadan kalbi doğrudan yeniden kas yapabilen tedavileri içeriyordu. Bununla birlikte, bu tür yeniden programlamanın etkinliğinin çok düşük olduğu ortaya çıktı ve alınan kardiyomiyosit benzeri hücrelerin fenotipi, olgun bir normal kardiyomiyositinkilere benzemiyor. Ayrıca, kardiyak transkripsiyon faktörlerinin yaralı murin kalplerine transplantasyonu, zayıf hücre sağkalımı ve kardiyak genlerin minimal ekspresyonu ile sonuçlandı.

Bu arada, kardiyak miyositleri in vitro elde etme yöntemlerinde ilerlemeler meydana geldi. İnsan iPS hücrelerinin verimli kardiyak farklılaşması, enfarktüslü sıçan kalplerinde tutulan progenitörlere yol açtı ve iskemik hasardan sonra kalbin yeniden şekillenmesini azalttı.

Sheng Ding liderliğindeki bilim insanlarından oluşan ekip, insan deri hücrelerinin atan kalp hücrelerine dönüştürülmesi için dokuz kimyasaldan (9C) oluşan bir kokteyl kullandı. Bu yöntemle hücrelerin %97'sinden fazlası, tam gelişmiş, sağlıklı kalp hücrelerinin bir özelliği olarak atmaya başladı. Kimyasal olarak indüklenen kardiyomiyosit benzeri hücreler (ciCM'ler), transkriptom, epigenetik ve elektrofizyolojik özelliklerinde insan kardiyomiyositlerine benzer şekilde kasıldı ve benziyordu. Enfarktüslü fare kalplerine nakledildiğinde, 9C ile tedavi edilen fibroblastlar verimli bir şekilde ciCM'lere dönüştürüldü ve organ içinde sağlıklı görünen kalp kası hücrelerine dönüştü. Bu kimyasal yeniden programlama yaklaşımı, daha fazla optimizasyondan sonra, kalp kasının yerel olarak yenilenmesini sağlayan ipuçlarını sağlamanın kolay bir yolunu sunabilir.

Başka bir çalışmada, murin enfarktüs modelindeki iskemik kardiyomiyopati , iPS hücre nakli ile hedeflenmiştir. Başarısız ventrikülleri senkronize ederek, gelişmiş sol ventrikül iletimi ve kontraktilitesi, azaltılmış skarlaşma ve yapısal yeniden yapılanmanın tersine çevrilmesi sayesinde yeniden senkronizasyon ve dekompanzasyondan koruma sağlamak için rejeneratif bir strateji sunar . Bir protokol , kolayca erişilebilir küçük moleküllü bileşikleri kullanarak, farklılaşma sırasında tanımlanmış zaman noktalarında kanonik Wnt sinyal yolunu basitçe modüle ederek hPSC'lerden %98'e kadar kardiyomiyosit popülasyonları oluşturdu .

Kardiyomiyositlerin oluşumunu kontrol eden mekanizmaların keşfi, hücre yüzeyini TGF-β reseptör tip II'den etkili bir şekilde temizleyen ve hücre içi TGF-β sinyalini seçici olarak inhibe eden ITD-1 ilacının geliştirilmesine yol açtı . Bu nedenle, bağlanmamış mezodermin kardiyomiyositlere farklılaşmasını seçici olarak arttırır , ancak vasküler düz kas ve endotel hücrelerine değil.

Bir proje, insan iPSC'den türetilen çok potansiyelli kardiyovasküler progenitör hücrelerle hücresizleştirilmiş fare kalplerini tohumladı. Yerleştirilen hücreler, kalpleri yeniden yapılandırmak için kardiyomiyositlere, düz kas hücrelerine ve endotel hücrelerine yerinde göç etti, çoğaldı ve farklılaştı. Ek olarak, kalbin hücre dışı matrisi (kalp iskelesinin substratı), insan hücrelerinin uygun kalp fonksiyonu için gerekli özel hücreler haline gelmesinin sinyalini verdi. Büyüme faktörleriyle 20 günlük perfüzyondan sonra, tasarlanmış kalp dokuları tekrar atmaya başladı ve ilaçlara yanıt verdi.

Kardiyak fibroblastların in situ indüklenmiş kardiyomiyosit benzeri hücrelere (iCM'ler) yeniden programlanması, kardiyak rejenerasyon için umut verici bir stratejiyi temsil eder. Fareler in vivo olarak üç kardiyak transkripsiyon faktörü GMT'ye (Gata4, Mef2c, Tbx5) ve küçük moleküllere: SB-431542 (dönüştürücü büyüme faktörü (TGF)-β inhibitörü) ve XAV939'a (WNT inhibitörü) 2 hafta boyunca maruz bırakıldı. miyokard enfarktüsünden sonra, sadece GMT'ye maruz kalanlara kıyasla önemli ölçüde iyileştirilmiş yeniden programlama (yeniden programlama verimliliği sekiz kat arttı) ve kardiyak fonksiyon gösterdi.

Şuna da bakın: gözden geçir

Kas kök hücresinin gençleştirilmesi

Yaşlılar , kısmen yaşlanan iskelet kası kök hücrelerinde p38a ve p38β mitojenle aktive olan kinaz yolunun artan aktivitesi nedeniyle sıklıkla ilerleyici kas zayıflığından ve rejeneratif başarısızlıktan muzdariptir . Bu tür kök hücreleri, yumuşak hidrojel substratlar üzerinde kültür ile birlikte p38a ve p38β'nin geçici inhibisyonuna tabi tutmak, onları hızla genişletir ve gençleştirir, bu da güçlerinin geri dönüşüyle ​​sonuçlanır.

Geriatrik farelerde, dinlenme uydu hücreleri, p16 INK4a'nın (Cdkn2a olarak da adlandırılır) derepresyonunun neden olduğu, geri dönüşü olmayan bir yaşlanma öncesi duruma geçerek tersine çevrilebilir sessizliği kaybeder . Yaralanma durumunda, bu hücreler genç bir ortamda bile aktifleşemez ve genişleyemez. Geriatrik uydu hücrelerinde p16INK4a susturma, sessizliği ve kas rejeneratif fonksiyonlarını geri yükler.

Hastalık modellemede veya iskelet kasını hedefleyen hücre bazlı tedavilerde potansiyel kullanım için miyojenik progenitörler , yüksek konsantrasyonlarla (100 ng/ml) takviye edilmiş bir kültür ortamında serbest yüzen küresel kültür (EZ küreleri) kullanılarak doğrudan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden üretilebilir. fibroblast büyüme faktörü-2 ( FGF-2 ) ve epidermal büyüme faktörü .

hepatositler

İnsan fibroblastlarından hepatosit türetmeye yönelik mevcut protokollerden farklı olarak , Saiyong Zhu ve diğerleri, (2014) iPSC'ler üretmedi, ancak küçük moleküller kullanarak, endoderm progenitör hücrelerin olduğu indüklenmiş bir multipotent progenitör hücre (iMPC) durumu oluşturmak için pluripotens için yeniden programlamayı kısalttı. ve ardından hepatositler (iMPC-Heps) verimli bir şekilde farklılaştı. İnsan karaciğer yetmezliğinin bağışıklık yetersizliği olan bir fare modeline transplantasyondan sonra, iMPC-Heps geniş ölçüde çoğaldı ve insan birincil yetişkin hepatositlerininkine benzer hepatosit fonksiyonu seviyeleri elde etti. iMPC-Heps, büyük olasılıkla hiçbir zaman pluripotent duruma girmedikleri için tümör oluşturmadı.

Bir bağırsak kripti - β-benzeri hücrelere dönüşmek için erişilebilir ve bol miktarda bağırsak epitel hücresi kaynağı.

Bu sonuçlar, otolog karaciğer hücresi tedavisine giden yolda uzun süredir devam eden bir engeli ortadan kaldıran, in vitro üretilen insan hepatositleri ile farelerin önemli karaciğer repopülasyonunun fizibilitesini ortaya koymaktadır.

Küçük moleküllerden oluşan bir kokteyl, Y-27632 , A-83-01 (bir TGFβ kinaz/aktivin reseptörü benzeri kinaz ( ALK5 ) inhibitörü) ve CHIR99021 ( GSK-3'ün güçlü inhibitörü ), sıçan ve fare olgun hepatositlerini in vitro dönüştürebilir proliferatif bipotent hücrelere - CLiP'ler (kimyasal olarak indüklenen karaciğer progenitörleri). CLiP'ler hem olgun hepatositlere hem de fonksiyonel duktal yapılar oluşturabilen biliyer epitel hücrelerine farklılaşabilir. Uzun süreli kültürde CLiP'ler proliferatif kapasitelerini ve hepatik farklılaşma yeteneklerini kaybetmediler ve kronik olarak yaralanmış karaciğer dokusunu çoğaltabilirler.

İnsülin üreten hücreler

Kardiyovasküler hastalıklar , retinopati , nöropati , nefropati ve periferik dolaşım hastalıkları gibi Diabetes mellitus komplikasyonları, pankreas beta hücrelerinden insülin eksikliğinden kaynaklanan şeker düzensizliğine bağlıdır ve tedavi edilmezlerse ölümcül olabilir. Diyabeti anlamak ve iyileştirmek için umut verici yaklaşımlardan biri, embriyonik kök hücreler (ESC'ler) ve indüklenmiş PCS'ler (iPSC'ler) dahil olmak üzere pluripotent kök hücreleri (PSC'ler) kullanmaktır. Ne yazık ki, insan PSC'den türetilen insülin ifade eden hücreler, yetişkin β hücrelerinden ziyade insan fetal β hücrelerine benzer. Yetişkin β hücrelerinin aksine, fetal β hücreleri, artan bazal glukoz sekresyonu ve glukoz stimülasyonu eksikliği ile gösterildiği ve transkriptlerinin RNA-sekansı ile doğrulandığı gibi, fonksiyonel olarak olgunlaşmamış görünmektedir .

Alternatif bir strateji, fibroblastların farklı endodermal progenitör hücre popülasyonlarına dönüştürülmesi ve sinyal faktörlerinin kokteylleri kullanılarak bu endodermal progenitör hücrelerin hem in vitro hem de in vivo olarak fonksiyonel beta benzeri hücrelere başarılı bir şekilde farklılaştırılmasıdır.

Üç transkripsiyon faktörünün , PDX1 ( pankreatik tomurcuk büyümesi ve beta hücre olgunlaşması için gereklidir ), NGN3 (endokrin öncü hücre oluşumu için gereklidir) ve MAFA (beta hücre olgunlaşması için) kombinasyonunun (PNM olarak adlandırılır) aşırı ekspresyonu , bazı hücre tiplerini beta hücre benzeri bir duruma sokar. Erişilebilir ve bol miktarda fonksiyonel insülin üreten hücre kaynağı bağırsaktır . İnsan bağırsak " organoidlerinde " PMN ekspresyonu , bağırsak epitel hücrelerinin transplantasyon için muhtemelen kabul edilebilir β benzeri hücrelere dönüşümünü uyarır .

nefron ataları

Yetişkin proksimal tübül hücreleri , öğretici transkripsiyon faktörlerinin altı geninden (SIX1, SIX2, OSR1, Eyes eksik homolog 1(EYA1), Homeobox A11 (HOXA11) ve Snail homolog 2'den oluşan bir havuz kullanılarak embriyonik böbreğin nefron progenitörlerine doğrudan transkripsiyonel olarak yeniden programlandı. (SNAI2)) yetişkin proksimal tübül hücre hattında bir kap mezenşimi / nefron progenitör fenotipi ile tutarlı genleri aktive etti . Bu tür hücrelerin üretilmesi, yetişkin böbrek hastalığı için hücresel tedavilere yol açabilir . Yetişkin sıçan böbreklerine yerleştirilen embriyonik böbrek organoidleri, ileriye dönük gelişim ve vasküler gelişimden geçebilir.

Kan damarı hücreleri

Kan damarları yaşlandıkça, genellikle yapı ve işlev açısından anormal hale gelirler ve böylece miyokard enfarktüsü, iskemik inme ve kalbi, beyni ve alt ekstremiteleri besleyen arterlerin aterosklerozu dahil olmak üzere yaşa bağlı sayısız hastalığa katkıda bulunurlar. Bu nedenle, önemli bir amaç, bu hastalıkların alevlenmesini önlemek için kollateral dolaşım için vasküler büyümeyi teşvik etmektir. İndüklenmiş Vasküler Progenitör Hücreler (iVPC'ler), koroner kollateral büyümeyi uyarmak için tasarlanmış hücre bazlı tedavi için faydalıdır. Endotel hücrelerini kısmen yeniden programlayarak üretildiler. iVPC'lerin vasküler bağlılığı, onları büyüyen kan damarlarının hücresel bileşenleri olarak ortaya çıkaran endotel hücrelerinin epigenetik hafızası ile ilgilidir. Bu nedenle, iVPC'ler miyokardiyuma implante edildiğinde kan damarlarına aşılandılar ve koroner kollateral akışı iPSC'lerden, mezenkimal kök hücrelerden veya doğal endotelyal hücrelerden daha iyi artırdılar.

Ex vivo genetik modifikasyon, kök hücre fonksiyonunu geliştirmek için etkili bir strateji olabilir. Örneğin, hücresel terapi ile genetik modifikasyon kullanılarak Pim-1 kinaz (bir aşağı akış efektörü Akt pozitif neovasculogenesis düzenleyen) kemik iliği ile birlikte, tamir dayanaklılığını miyokardiyum sonuçları başarısız izole türevi hücreleri veya insan kardiyak progenitör hücreleri, miyokardiyal hemodinamik performansın fonksiyonel parametrelerinin iyileştirilmesi.

Liposuction sonrası yağ dokusundan alınan kök hücreler , arterlerde ve damarlarda bulunan progenitör düz kas hücrelerine (iPVSMC'ler) dönüştürülebilir.

İnsan iPS hücrelerinin 2D kültür sistemi, üçlü işaretleyici seçimi ( CD34 (gelişimsel olarak erken embriyonik fibroblastlarda eksprese edilen bir yüzey glikofosfoproteini), NP1 (reseptör – nöropilin 1) ve KDR (kinaz ek alanı içeren reseptör)) izolasyonu için insan iPSC'sinden elde edilen vaskülojenik öncü hücreler, transplantasyondan sonra, in vivo olarak 280 gün süren stabil, fonksiyonel fare kan damarları oluşturan endotelyal hücreler üretti.

Enfarktüs tedavisi için fibrotik skar dokusu oluşumunu önlemek önemlidir. Bu, doğal kalp progenitör kök hücre katkılarını skar dokusundan kardiyovasküler dokuya yönlendiren parakrin faktörlerin geçici olarak uygulanmasıyla in vivo olarak elde edilebilir . Örneğin, bir fare miyokard enfarktüsü modelinde, vücudun normal savunma sisteminden kaçmak için modifiye edilmiş insan vasküler endotelyal büyüme faktörü A mRNA'sının (VEGF-A modRNA) tek bir intramiyokardiyal enjeksiyonu, mobilizasyon nedeniyle kalp fonksiyonunun uzun vadeli iyileşmesiyle sonuçlanır. ve epikardiyal progenitör hücrelerin kardiyovasküler hücre tiplerine yönlendirilmesi.

Kan kök hücreleri

Kırmızı kan hücreleri

RBC transfüzyonu birçok hasta için gereklidir. Bununla birlikte, bugüne kadar RBC'lerin arzı kararsız kalmaktadır. Ek olarak, transfüzyon bulaşıcı hastalık bulaşma riskini de beraberinde getirir. In vitro üretilen büyük miktarda güvenli RBC kaynağı bu sorunun çözülmesine yardımcı olacaktır. Ex vivo eritroid hücre üretimi, mevcut ve gelecekteki klinik gereksinimleri karşılamak için alternatif transfüzyon ürünleri sağlayabilir. Mobilize CD34 pozitif hücrelerden in vitro üretilen kırmızı kan hücreleri (RBC) , otolog bir alıcıya transfüze edildiğinde normal hayatta kalma gösterir. İn vitro üretilen RBC, yalnızca bu RBC'lerin işlevselliğini kurtaran fetal hemoglobin (HbF) içerir. İn vivo olarak, iPSC'lerden türetilen çekirdekli eritroid öncüllerinin infüzyonundan sonra fetal hemoglobinden yetişkin hemoglobine geçiş gözlemlendi . RBC'lerin çekirdekleri olmamasına ve bu nedenle bir tümör oluşturamamasına rağmen, hemen eritroblast öncüllerinin çekirdekleri vardır. Eritroblastların fonksiyonel RBC'lere terminal olgunlaşması, çekirdeğin ekstrüzyonu ve çekirdeksiz bir RBC'nin oluşumu ile biten karmaşık bir yeniden şekillenme sürecini gerektirir. Hücre yeniden programlama genellikle enükleasyonu bozar. İn vitro olarak oluşturulmuş eritrositlerin veya eritroblastların transfüzyonu, tümör oluşumuna karşı yeterli koruma sağlamaz.

Aril (kanser hücresi gelişiminin desteklenmesinde rol oynadığı gösterilmiştir) bir hidrokarbon reseptörü (AHR) geçiş yolu, normal kan hücre gelişiminde önemli bir rol oynar. İnsan hematopoietik progenitör hücrelerinde (HP'ler) AhR aktivasyonu, HP'lerin, megakaryosit ve eritroid soy hücrelerinin benzeri görülmemiş bir genişlemesini sağlar. Ayrıca bkz. Kısa İnceleme: SH2B3 geni, sitokin sinyallemesinin negatif düzenleyicisini kodlar ve bu gende doğal olarak meydana gelen fonksiyon kaybı varyantları, in vivo olarak RBC sayımlarını artırır. Birincil insan hematopoietik kök ve progenitör hücrelerinde SH2B3'ün hedeflenen baskılanması, in vitro türevli RBC'lerin olgunlaşmasını ve genel verimini arttırdı. Ayrıca, SH2B3'ün insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR / Cas9 genom düzenlemesi ile etkisizleştirilmesi, korunmuş farklılaşma ile gelişmiş eritroid hücre genişlemesine izin verdi. (Ayrıca genel bakışa bakın.)

Megakaryositlerden ekstrüde edilen trombositler

trombositler

Trombositler yardım içinde kanamayı önlemek trombositopenik hastalarda ve hastalar trombositeminin . Çoklu transfüzyon yapılan hastalar için önemli bir problem trombosit transfüzyonlarına refrakterliktir. Bu nedenle, serumsuz ortamda trombosit ürünlerini ex vivo ve HLA antijenleri içermeyen trombosit ürünlerini üretme yeteneği klinik değere sahip olacaktır. Bir RNA interferans merkezli mekanizma kullanılır lentiviral vektör CD34-pozitif hücrelerde β2-mikroglobulin kopyalarım hedef alan kısa saç tokası RNAi ifade etmek. Üretilen trombositler, sınıf I HLA antijenlerinde %85'lik bir azalma gösterdi. Bu trombositlerin in vitro olarak normal işlevi olduğu görüldü.

İnsan iPSC'sinden fonksiyonel trombositlerin türetilmesi için klinik olarak uygulanabilir bir strateji , BMI1 ve BCL-XL'in doksisikline bağımlı aşırı ekspresyonu yoluyla stabil ölümsüzleştirilmiş megakaryosit progenitör hücre hatlarının (imMKCL'ler) oluşturulmasını içerir . Elde edilen imMKCL'ler, kriyoprezervasyondan sonra bile kültürde uzun süreler (4-5 ay) boyunca genişletilebilir . C-myc, ve (ortamından doksisiklin çıkarılmasıyla) aşırı ifadesini durdurulması BMI1 ve Bcl-xL üretilmesine yol açmıştır büyüyen imMKCLs içinde CD42b deneylerde, bir dizi temelinde doğal trombositlerin edilene benzer işlevlere sahip + trombositler in vitro ve in vivo. .: Thomas ve diğerleri, 3 transkripsiyon faktörlerinin eş zamanlı eksojen ifadesi güvenerek bir ileri programlama stratejisi tarif gata1 , fli1 ve TAL1 . İleri programlanmış megakaryositler % 90 2x10 ulaşan üzerinde megakaryosıt saflıkla aylarca kültürde çoğalmaya ve ayrıştırıcı bir ⁵ giriş hPSC başına megakaryositleri olgunlaşır. Fonksiyonel trombositler, bir milyon kadar az başlangıç ​​hPSC'sinden birkaç transfüzyon ünitesinin ileriye dönük olarak toplanmasına izin vererek kültür boyunca üretilir. Ayrıca genel bakışa bakın

Bağışıklık hücreleri

Sitotoksik T lenfositler (CTL'ler) olarak bilinen özel bir beyaz kan hücresi türü , bağışıklık sistemi tarafından üretilir ve çeşitli bulaşıcı veya tümör hücrelerinin yüzeyindeki belirli belirteçleri tanıyarak zararlıları öldürmek için bir saldırı başlatmalarına neden olur. hücreler. Bu nedenle, fonksiyonel antijene özgü T hücreleri ile immünoterapi, birçok kanser ve viral enfeksiyonla mücadele için terapötik bir strateji olarak potansiyele sahiptir. Ancak hücre kaynakları, doğal olarak az sayıda üretildiği ve kısa ömürlü olduğu için sınırlıdır.

Antijene özgü CTL'lerin üretilmesi için potansiyel olarak etkili bir yaklaşım, olgun immün T hücrelerini, in vitro belirsiz çoğalma kapasitesine sahip olan iPSC'lere geri döndürmek ve çoğalmalarından sonra onları T hücrelerine yeniden farklılaşmaya ikna etmektir.

Başka bir yöntem, doku kültüründe malign B hücreleri tarafından eksprese edilen bir antijen olan CD19'u hedef alan insan T hücrelerini oluşturmak için iPSC ve kimerik antijen reseptörü (CAR) teknolojilerini birleştirir . Terapötik insan T hücrelerinin üretilmesine yönelik bu yaklaşım, kanser immünoterapisi ve diğer tıbbi uygulamalar için faydalı olabilir.

Değişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücreleri, kanser immünoterapisi için adjuvanlar olarak büyük klinik potansiyele sahiptir . iNKT hücreleri doğuştan gelen T lenfositleri gibi davranır ve doğuştan gelen ve kazanılmış bağışıklık sistemleri arasında bir köprü görevi görür . İnterferon-gama (IFN-y) üreterek anti-tümör tepkilerini arttırırlar. İlgili tümör tedavisi için toplama, yeniden programlama/farklılığı giderme, yeniden farklılaştırma ve enjeksiyon yaklaşımı önerilmiştir.

Dendritik hücreler (DC), T-hücre yanıtlarını kontrol etmek için uzmanlaşmıştır. Uygun genetik modifikasyonlara sahip DC, antijene özgü CTL'yi uyarmak için yeterince uzun süre hayatta kalabilir ve bundan sonra tamamen ortadan kaldırılabilir. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden elde edilen DC benzeri antijen sunan hücreler, aşı tedavisi için bir kaynak olarak hizmet edebilir .

CCAAT / güçlendirici bağlayıcı protein-α (C / EBPα) arasında indükler transdiferansiasyon B hücreleri içine makrofajlar transkripsiyon ile birlikte ifade iPS hücrelerine yeniden programlama yüksek verimlilik ve artıran en Oct4, Sox2 Klf4 ve Myc faktörleri. nüfusun %95'ini içeren iPS hücre yeniden programlama verimliliğinde 100 kat artış ile. Ayrıca, C/EBPa, seçilmiş insan B hücre lenfomasını ve lösemi hücre dizilerini yüksek verimlilikte makrofaj benzeri hücrelere dönüştürerek hücrelerin tümör oluşturma kapasitesini bozabilir.

Timik epitel hücreleri gençleştirme

Timus insanlar yaş olarak bozulmaya ilk organdır. Bu küçülme, bağışıklık sisteminin yaşla birlikte daha az etkili olmasının ana nedenlerinden biridir. Timik epitelyal hücre transkripsiyon faktörü FOXN1'in azalmış ifadesi, yaşa bağlı involüsyonu düzenleyen mekanizmanın bir bileşeni olarak gösterilmiştir.

Clare Blackburn ve meslektaşları, yaşa bağlı yerleşik timik involüsyonun, bu hücrelerin gençleşmesini , çoğalmasını ve tamamen işlevsel timik epitelde farklılaşmasını teşvik etmek için timik epitel hücrelerinde sadece bir transkripsiyon faktörünün - FOXN1'in zorla yukarı regülasyonu ile tersine çevrilebileceğini gösteriyor . Bu gençleşme ve artan proliferasyona, hücre döngüsü ilerlemesini destekleyen ( siklin D1 , ΔN p63 , FgfR2IIIb ) ve T hücresi gelişiminin belirli yönlerini desteklemek için timik epitel hücrelerinde gerekli olan genlerin yukarı regülasyonu eşlik etti ( Dll4 , Kitl , Ccl25 , Cxcl12). , Cd40 , Cd80 , Ctsl , Pax1 ). Gelecekte, bu yöntem , timusu yerinde gençleştirerek bağışıklık fonksiyonunu geliştirmek ve hastalarda iltihaplanma ile mücadele etmek için yaygın olarak kullanılabilir .

Mezenkimal kök hücreler

indüksiyon

Mezenkimal kök/stromal hücreler (MSC'ler), kardiyak, renal, nöral, eklem ve kemik onarımının yanı sıra inflamatuar koşullar ve hemopoietik birlikte transplantasyondaki uygulamalar için araştırılmaktadır. Bunun nedeni, immünosupresif özellikleri ve çok çeşitli mezenkimal soy dokularına farklılaşma yetenekleridir. MSC'ler tipik olarak yetişkin kemik iliğinden veya yağdan toplanır, ancak bunlar ağrılı invaziv prosedürler gerektirir ve düşük frekanslı kaynaklardır, kemik iliği hücrelerinin yalnızca %0,001–0,01'ini ve liposuction aspiratlarında %0,05'ini oluşturur. Otolog kullanım için endişe verici olan, özellikle doku onarımına en çok ihtiyaç duyan yaşlılarda, MSC'lerin miktar ve kalitesi yaşla birlikte azalır.

IPSC'ler, asırlıkların bile hücre gençleşmesiyle elde edilebilir. iPSC'ler etik kısıtlamalar olmaksızın hasat edilebildiğinden ve kültür süresiz olarak genişletilebildiğinden, bunlar avantajlı bir MSC kaynağıdır. SB-431542 ile IPSC işlemi , insan iPSC'lerinden hızlı ve tek tip MSC üretimine yol açar. (SB-431.542 engelleyerek aktivin / TGF yolları bir inhibitörü olan fosforilasyon bölgesinin ALK4 , ALK5'e ve ALK7 reseptörleri). Bu iPS-MSC'ler, teratom oluşturucu yeteneğinden yoksun kültür ve sergi büyüme ve farklılaşma özellikleri bu normal sabit karyotipine görüntüleyebilir birincil MSC'lere çok benzer. MSC tabanlı tedavileri mümkün kılan in vitro ölçek büyütme potansiyeline sahiptir. iPSC'den türetilen MSC, periodontal rejenerasyona yardımcı olma kapasitesine sahiptir ve periodontitisin klinik tedavisinde kullanım için umut verici bir kolayca erişilebilir kök hücre kaynağıdır.

Lai ve diğerleri, & Lu, 3 ile veya 3 olmadan altı kimyasal inhibitör (SP600125, SB202190, Go6983, Y-27632, PD0325901 ve CHIR99021) kullanarak insan birincil dermal fibroblastlarından MSC benzeri hücreler (iMSC'ler) üretmek için kimyasal yöntemi bildirmektedir. büyüme faktörleri (dönüştürücü büyüme faktörü-β (TGF-β), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve lösemi inhibitör faktör (LIF)). Kimyasal kokteyl, insan fibroblastlarını 6 gün içinde tek katmanlı bir kültürle doğrudan iMSC'lere dönüştürür ve dönüşüm oranı yaklaşık %38'dir.

İn vivo hücre tedavisinin yanı sıra, insan mezenkimal kök hücrelerinin kültürü, ilaç dağıtımı için ideal araçlar olan eksozomların seri üretimi için in vitro olarak kullanılabilir .

Farklılaşmamış adipositler

Yağ dokusu, bolluğu ve nispeten daha az istilacı hasat yöntemleri nedeniyle, bir mezenkimal kök hücre (MSC) kaynağını temsil eder. Ne yazık ki, liposuction aspiratları sadece %0.05 MSC'dir. Bununla birlikte, genel olarak çoğalma yeteneklerini kaybetmiş ve bu nedenle tipik olarak atılan büyük miktarda olgun adiposit, adipoz hücre süspansiyonundan kolayca izole edilebilir ve farklılaşmamış yağ (DFAT) hücreleri olarak adlandırılan lipid içermeyen fibroblast benzeri hücrelere farklılaştırılabilir. . DFAT hücreleri, aktif çoğalma yeteneğini yeniden kurar ve multipotent kapasiteleri ifade eder. Yetişkin kök hücrelerle karşılaştırıldığında, DFAT hücreleri bolluk, izolasyon ve homojenlik açısından benzersiz avantajlar gösterir. İn vitro uygun indüksiyon kültürü veya in vivo uygun ortam altında, DFAT hücreleri adipojenik, osteojenik, kondrojenik ve miyojenik potansiyeller gösterebilir. Ayrıca perivasküler özellikler sergileyebilir ve neovaskülarizasyona neden olabilirler.

kondrojenik hücreler

Kıkırdak , sürtünmesiz eklem hareketinden sorumlu bağ dokusudur. Dejenerasyonu sonuçta osteoartritin geç evrelerinde eklem fonksiyonunun tamamen kaybıyla sonuçlanır . Avasküler ve hiposelüler bir doku olarak, kıkırdak kendi kendini onarma kapasitesi sınırlıdır. Kondrositler , salgıladıkları ve bir araya getirdikleri hücre dışı matris ile çevrelendikleri kıkırdaktaki tek hücre tipidir.

Kıkırdak üretmenin bir yöntemi, onu iPS hücrelerinden uyarmaktır. Alternatif olarak, üç yeniden programlama faktörü (c-MYC, KLF4 ve SOX9) eklenerek fibroblastları, bir ara iPS hücre aşaması olmadan doğrudan indüklenmiş kondrojenik hücrelere (iChon) dönüştürmek mümkündür. İnsan iChon hücreleri, kondrositler (tip II kollajen) için işaretleyici genleri eksprese etti, ancak fibroblastları ifade etmedi.

Sıçanların eklem kıkırdağında oluşturulan kusurlara implante edilen insan iChon hücreleri, en az dört hafta boyunca hiçbir tümör olmadan kıkırdaklı doku oluşturmak üzere hayatta kaldı. Yöntem, tümör oluşumunda önemli bir rolü olduğu düşünülen c-MYC'yi kullanır ve insan tedavisinde değiştirilmemiş kullanımın dışında, yeniden programlama faktörlerini tanıtmak için bir retrovirüs kullanır .

Yeniden programlama için hücre kaynakları

Yeniden programlama için en sık kullanılan kaynaklar, deri biyopsisi ile elde edilen kan hücreleri ve fibroblastlardır, ancak hücrelerin idrardan alınması daha az invazivdir. İkinci yöntem biyopsi veya kan örneği gerektirmez. 2013 itibariyle, idrar kaynaklı kök hücreler, teratom oluşturmadan endotelyal, osteojenik, kondrojenik, adipojenik, iskelet miyojenik ve nörojenik soylara farklılaştırılmıştı. Bu nedenle, epigenetik hafızaları, iPS hücrelerine yeniden programlamaya uygundur. Bununla birlikte, idrarda az sayıda hücre görülür, yalnızca düşük dönüşüm verimliliği elde edilmiştir ve bakteri kontaminasyonu riski nispeten yüksektir.

Yeniden programlama için umut verici bir başka hücre kaynağı, insan saç köklerinden elde edilen mezenkimal kök hücrelerdir.

Yeniden programlama için kullanılan somatik hücrelerin kökeni, yeniden programlamanın etkinliğini, ortaya çıkan indüklenmiş kök hücrelerin fonksiyonel özelliklerini ve tümör oluşturma yeteneğini etkileyebilir.

IPSC'ler, farklılaşma potansiyellerini etkileyen menşe dokularının epigenetik bir hafızasını korur. Bu epigenetik hafıza, pluripotens aşamasında mutlaka kendini göstermez - farklı dokulardan türetilen iPSC'ler uygun morfoloji sergiler, pluripotens belirteçlerini ifade eder ve in vitro ve in vivo olarak üç embriyonik katmana farklılaşabilir. Bununla birlikte, bu epigenetik hafıza, kalıntı epigenetik işaretler taşıyan spesifik lokusları gerektiren spesifik hücre tiplerine yeniden farklılaşma sırasında ortaya çıkabilir.

Ayrıca bakınız

Referanslar

daha fazla okuma