Cas9 - Cas9

CRISPR ile ilişkili endonükleaz Cas9
Kılavuz RNA ve Hedef DNA ile Komplekste Cas9'un Kristal Yapısı.jpg
2.5 A ˚ çözünürlükte sgRNA ve hedef DNA'sı ile kompleks halinde S. pyogenes Cas9'un kristal yapısı .
tanımlayıcılar
organizma Streptococcus pyogenes M1
Sembol cas9
Alt. semboller SpCas9
Entrika 901176
PDB 4OO8
RefSeq (mRNA) NC_002737.2
RefSeq (Koruma) NP_269215,1
UniProt Q99ZW2
Diğer veri
EC numarası 3.1.-.-
Kromozom Genomik: 0,85 - 0,86 Mb
Cas9
tanımlayıcılar
Sembol ?
InterPro IPR028629

Cas9 ( RISPR olarak sociated proteini 9 eski Cas5, Csn1 veya Csx12 adlandırılır) bir 160 kilodaltonluk bir protein karşı bazı bakterilerin immünolojik savunma önemli bir rol oynar DNA virüsleri ve plazmid ve yoğun olarak kullanıldığı genetik mühendisliği uygulamaları. Ana işlevi, DNA'yı kesmek ve böylece bir hücrenin genomunu değiştirmektir. CRISPR-Cas9 genom düzenleme tekniği önemli bir katkı yapmıştır Nobel Kimya Ödülü 2020 yılında verilen ediliyor Emmanuelle Charpentier'de ve Jennifer Doudna .

Daha teknik olarak, Cas9, Streptococcus pyogenes'teki Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ( CRISPR ) adaptif bağışıklık sistemi ile ilişkili bir çift RNA- güdümlü DNA endonükleaz enzimidir . S. pyogenes , ezberlemek için CRISPR'yi ve daha sonra istilacı bakteriyofaj DNA'sı veya plazmit DNA'sı gibi yabancı DNA'yı sorgulamak ve parçalamak için Cas9'u kullanır . Cas9 bu sorgulamayı, yabancı DNA'yı çözerek ve kılavuz RNA'nın 20 baz çifti ayırıcı bölgesini tamamlayan yerleri kontrol ederek gerçekleştirir . DNA substratı kılavuz RNA'yı tamamlayıcı ise, Cas9 istilacı DNA'yı parçalar. Bu anlamda, CRISPR-Cas9 mekanizmasının ökaryotlardaki RNA interferansı (RNAi) mekanizması ile bir takım paralellikleri vardır .

Bakteriyel bağışıklıktaki orijinal işlevinin yanı sıra, Cas9 proteini, DNA'da bölgeye yönelik çift sarmal kırılmalarını indüklemek için bir genom mühendisliği aracı olarak yoğun bir şekilde kullanılmıştır. Bu kırılmalar, birçok laboratuvar modeli organizmasında sırasıyla homolog olmayan uç birleştirme ve homolog rekombinasyon yoluyla gen inaktivasyonuna veya heterolog genlerin girmesine yol açabilir . Çinko parmak nükleazları ve Transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleaz (TALEN) proteinlerinin yanı sıra Cas9, genom düzenleme alanında öne çıkan bir araç haline geliyor.

Cas9, kılavuz RNA'yı tamamlayan hemen hemen her diziyi parçalayabildiği için son yıllarda çekiş kazanmıştır. Cas9'un hedef özgüllüğü, kılavuz RNA:DNA tamamlayıcılığından kaynaklandığından ve proteinin kendisinde yapılan değişikliklerden (TALEN'ler ve çinko parmaklar gibi ) kaynaklandığından, Cas9'u yeni DNA'yı hedeflemek için tasarlamak basittir. Cas9'un aynı kökenli DNA'yı bağlayan ancak parçalamayan versiyonları, transkripsiyonel aktivasyonu ve baskıyı kontrol etmek için transkripsiyonel aktivatörü veya baskılayıcıları spesifik DNA dizilerine yerleştirmek için kullanılabilir. Native Cas9, ilişki kuran iki farklı RNA'dan oluşan bir kılavuz RNA gerektirir - CRISPR RNA (crRNA) ve trans-aktive edici crRNA ( tracrRNA ). Cas9 hedeflemesi, kimerik bir tek kılavuz RNA'nın (chiRNA) mühendisliği yoluyla basitleştirilmiştir. Bilim adamları, Cas9 tabanlı gen sürücülerinin tüm organizma popülasyonlarının genomlarını düzenleyebileceğini öne sürdüler . 2015 yılında Cas9 ilk kez insan embriyolarının genomunu değiştirmek için kullanıldı.

CRISPR aracılı bağışıklık

Bakteriyofajlar , bakteriler ve arkelerle dolu çeşitli zorlu, misafirperver olmayan habitatlarda hayatta kalmak için yırtıcı virüslerden kaçmak ve onları savuşturmak için yöntemler geliştirmiştir . Bu, CRISPR adaptif bağışıklık sistemini içerir. Pratikte, CRISPR/Cas sistemleri kendi kendine programlanabilen kısıtlama enzimleri olarak işlev görür. CRISPR lokusları, alternatif CRISPR tekrarlarından ve 24-48 nükleotid uzunluğundaki değişken CRISPR aralıklarından oluşan düzenli aralıklarla meydana gelen kısa, palindromik tekrarlardan oluşur. Bu CRISPR lokuslarına genellikle bitişik CRISPR ile ilişkili (cas) genler eşlik eder. 2005 yılında, üç ayrı grup tarafından, boşluk bölgelerinin, plazmitler ve virüsler dahil olmak üzere yabancı DNA elemanlarına homolog olduğu keşfedildi. Bu raporlar, CRISPR'lerin bir bağışıklık sistemi olarak işlev görebileceğine dair ilk biyolojik kanıtı sağladı.

Cas9, sıklıkla bir genom düzenleme aracı olarak kullanılmıştır. Cas9, virüslerin konakçıların DNA'sını manipüle etmesini önlemede son gelişmelerde kullanılmıştır. CRISPR-Cas9, bakteri genom sistemlerinden geliştirildiğinden, virüslerdeki genetik materyali hedeflemek için kullanılabilir. Cas9 enziminin kullanımı birçok viral enfeksiyona çözüm olabilir. Cas9, viral genetik bilginin belirli zincirlerini hedefleyerek belirli virüsleri hedefleme yeteneğine sahiptir. Daha spesifik olarak Cas9 enzimi, virüsün normal işlevini yerine getirmesini engelleyen viral genomun belirli bölümlerini hedefler. Cas9 ayrıca hastalıklara ve mutasyona uğramış DNA zincirlerine neden olan zararlı DNA ve RNA zincirini bozmak için kullanılmıştır. Cas9, HIV-1'in etkilerini bozma konusunda şimdiden umut vaat etti. Cas9'un HIV-1'deki uzun terminal tekrarlarının ifadesini bastırdığı gösterilmiştir. HIV-1 genomuna dahil edildiğinde Cas9, HIV-1 ipliklerini mutasyona uğratma yeteneğini göstermiştir. Cas9, hepatit b viral genomundaki belirli uzun terminal tekrarların uçlarının hedeflenmesi yoluyla hepatit b tedavisinde de kullanılmıştır. Cas9, farelerde katarakta neden olan mutasyonları onarmak için kullanılmıştır.

Şekil 2: CRISPR bağışıklığının Aşamaları

CRISPR-Cas sistemleri, genetik içeriklerine ve yapısal farklılıklarına göre üç ana tipe (tip I, tip II ve tip III) ve on iki alt tipe ayrılır. Bununla birlikte, tüm CRISPR-Cas sistemlerinin temel tanımlayıcı özellikleri, cas genleri ve bunların proteinleridir: cas1 ve cas2, tipler ve alt tipler arasında evrenseldir; cas3 , cas9 ve cas10 ise tip I, tip II ve tip III için imza genleridir. , sırasıyla.

CRISPR-Cas savunma aşamaları

Adaptasyon

Adaptasyon , CRISPR lokusunda iki bitişik tekrar arasındaki aralayıcıların tanınmasını ve entegrasyonunu içerir. "Protospacer", aralayıcıya karşılık gelen viral genom üzerindeki diziyi ifade eder. Kısa bir korunmuş nükleotid dizisi, protospacer bitişik motifi (PAM) olarak adlandırılan protospacer'ın proksimalinde bulunur. PAM, DNA parçasını elde etmek için kullanılan bir tanıma motifidir. Tip II'de Cas9, işlevsel aralayıcıların edinilmesini sağlamak için adaptasyon sırasında PAM'ı tanır.

CRISPR işleme/biyogenez

CRISPR ifadesi , CRISPR lokusundan RNA polimeraz tarafından kopyalanan, CRISPR RNA (pre-crRNA) adı verilen bir birincil transkriptin transkripsiyonunu içerir. Spesifik endoribonükleazlar daha sonra pre-crRNA'ları küçük CRISPR RNA'lara (crRNA'lar) ayırır.

girişim/bağışıklık

Girişim, tamamlayıcı yabancı DNA ekleme bölgelerini tanıyabilen ve spesifik olarak baz çifti oluşturabilen CASCADE adı verilen çok proteinli bir kompleks içindeki crRNA'ları içerir. Daha sonra crRNA-yabancı nükleik asit kompleksi bölünür, ancak aralayıcı ve hedef DNA arasında uyumsuzluklar varsa veya PAM'de mutasyonlar varsa, bölünme başlatılmayacaktır. İkinci senaryoda, yabancı DNA hücre tarafından saldırıya uğramaz, bu nedenle virüsün replikasyonu devam eder ve konakçı viral enfeksiyona karşı bağışık değildir. Girişim aşaması, CRISPR edinimi ve ifadesinden mekanik ve zamansal olarak farklı olabilir, ancak bir savunma sistemi olarak tam işlev için üç fazın da işlevsel olması gerekir.

Aşama 1: CRISPR ara parçası entegrasyonu. Protospacer'ler ve protospacer ile ilişkili motifler (kırmızı ile gösterilmiştir), konakçı DNA'daki bir CRISPR dizisinin "lider" ucunda elde edilir. CRISPR dizisi, tekrarlarla (siyah elmaslar) çevrili aralayıcı dizilerinden (renkli kutularda gösterilmiştir) oluşur. Bu işlem, genellikle CRISPR dizisinin yakınında bulunan cas lokusunda kodlanmış Cas1 ve Cas2'yi (ve tip II'de Cas9) gerektirir.

Aşama 2: CRISPR ifadesi. Ön-crRNA, lider bölgede konakçı RNA polimeraz tarafından başlayarak kopyalanır ve daha sonra Cas proteinleri tarafından tek bir aralayıcı ve kısmi bir tekrar içeren daha küçük crRNA'lara bölünür (renkli aralayıcılarla firkete yapısı olarak gösterilir).

Aşama 3: CRISPR paraziti. Gelen yabancı DNA ile güçlü tamamlayıcılığa sahip bir aralayıcıya sahip crRNA, Cas proteinleri gerektiren bir bölünme olayı (makasla tasvir edilmiştir) başlatır. DNA bölünmesi viral replikasyona müdahale eder ve konakçıya bağışıklık sağlar. Girişim aşaması, CRISPR edinme ve ifadesinden işlevsel ve geçici olarak farklı olabilir (hücreyi bölen beyaz çizgi ile gösterilir).

dCas9 kullanarak transkripsiyonun devre dışı bırakılması

Endonükleaz eksikliği olan Cas9 olarak da adlandırılan dCas9, bir genin istenen bölümünün transkripsiyon bağlama bölgesine uygulandığında gen ekspresyonunu düzenlemek için kullanılabilir. DCas9'un optimal işlevi, hareket tarzına atfedilir. Nükleotitler artık RNA zincirine eklenmediğinde ve dolayısıyla bu zincirin uzamasını sonlandırdığında gen ekspresyonu inhibe edilir ve sonuç olarak transkripsiyon sürecini etkiler. Bu süreç, dCas9 seri olarak üretildiğinde gerçekleşir, böylece diziye özgü bir kılavuz RNA molekülü aracılığıyla herhangi bir zamanda en fazla miktarda geni etkileyebilir. DCas9'un gen ekspresyonunu aşağı regüle ettiği göründüğünden, bu etki, baskıcı kromatin değiştirici etki alanları ile birlikte kullanıldığında daha da güçlendirilir. DCas9 proteini, gen ekspresyonunun düzenlenmesi dışında başka işlevlere sahiptir. DCas9 proteinine, bir DNA dizisi boyunca farklı dizilerde transkripsiyonun başlatılmasında veya durdurulmasında verimli olmak için birbirleriyle çalışmasına izin veren bir promotör eklenebilir. Bu iki protein, bir gen üzerinde hareket ettikleri yerde spesifiktir. Bu, bir promotör ve dCas9, kopyalanmış bir DNA parçası oluşturmak üzere bir araya gelen nükleotit polimerinin uzama kabiliyetini engellemek için kendilerini bir araya getirdiğinde, belirli prokaryot türlerinde yaygındır. Promotör olmadan, dCas9 proteini tek başına veya bir gen gövdesi ile aynı etkiye sahip değildir.

Transkripsiyonun baskılanmasının etkileri daha fazla incelenirken, bir histonun bir amino asit bileşeni olan H3K27, dCas9 ve FOG1 adı verilen bir peptidin etkileşimi yoluyla metillenir. Esasen bu etkileşim, genin spesifik kavşağında amino asit kompleksinin C + N terminal bölümünde gen baskısına neden olur ve sonuç olarak transkripsiyonu sonlandırır.

dCas9 ayrıca, hastalık oluşturabilen belirli proteinlerin değiştirilmesi söz konusu olduğunda da etkili olduğunu kanıtlıyor. DCas9, kılavuz-RNA adı verilen bir RNA formuna bağlandığında, bir organizmanın genomuna zararlı olabilecek tekrarlayan kodonların ve DNA dizilerinin çoğalmasını önler. Esasen, birden fazla tekrar kodonu üretildiğinde, bir yanıt ortaya çıkarır veya bu kodonların aşırı üretimiyle mücadele etmek için bol miktarda dCas9 alır ve transkripsiyonun kapanmasıyla sonuçlanır. dCas9, gRNA ile sinerjistik olarak çalışır ve DNA polimeraz II'yi devam eden transkripsiyondan doğrudan etkiler.

DCas9 proteininin nasıl çalıştığına dair daha fazla açıklama, bitkilerde gen üretiminin belirli özellikleri artıracak veya azaltacak şekilde düzenlenmesiyle bitki genomlarını kullanmalarında bulunabilir. CRISPR-CAS9 sistemi, genleri yukarı regüle etme veya aşağı regüle etme yeteneğine sahiptir. DCas9 proteinleri, CRISPR-CAS9 sisteminin bir bileşenidir ve bu proteinler, bir bitki geninin belirli alanlarını baskılayabilir. Bu, dCAS9 baskılayıcı alanlara bağlandığında olur ve bitkiler söz konusu olduğunda, AtCSTF64 gibi düzenleyici bir genin deaktivasyonu meydana gelir.

Bakteriler de dCas9 proteinlerinin kullanımının başka bir odak noktasıdır. Ökaryotlar daha büyük bir DNA yapısına ve genomuna sahip olduğundan; çok daha küçük bakterilerin manipüle edilmesi kolaydır. Sonuç olarak ökaryotlar, RNA polimerazın genetik materyalin transkripsiyon sürecini sürdürmesini engellemek için dCas9'u kullanır.

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar

Kristal yapı

Cas9 Yapısı
Nishimasu ve diğerleri tarafından PDB 5AXW'ye dayanan CRISPR ile ilişkili protein Cas9'un kristal yapısı .

Cas9, alfa sarmal lob (mavi) ve nükleaz lobu (camgöbeği, turuncu ve gri) arasına yerleştirilmiş kılavuz RNA ile iki loblu bir mimariye sahiptir. Bu iki lob, tek bir köprü sarmalı ile birbirine bağlanır. Çok alanlı nükleaz lobunda yer alan iki nükleaz alanı vardır, hedef olmayan DNA zincirini ayıran RuvC (gri) ve DNA'nın hedef zincirini ayıran HNH nükleaz alanı (camgöbeği). RuvC alanı, RuvC bölünme alanını oluşturmak için üçüncül yapıda etkileşime giren sıralı olarak farklı siteler tarafından kodlanır (sağdaki şekle bakın).

Apo formunda Cas9'un kristal yapısı. Yapısal yorumlama, UCSF Chimera yazılımı kullanılarak yapıldı.

Hedef DNA'nın önemli bir özelliği, üç nükleotid dizisi-NGG'den oluşan bir protospacer bitişik motifi (PAM) içermesi gerektiğidir. Bu PAM, Cas9'un C-terminal ucunun yakınında bulunan PAM etkileşimli etki alanı (PI alanı, turuncu) tarafından tanınır. Cas9, apo, kılavuz RNA bağlı ve kılavuz RNA:DNA bağlı durumlar arasında belirgin konformasyonel değişikliklere uğrar.

Cas9 , crRNA-tracrRNA ribonükleoprotein kompleksinin olgunlaşmasına aracılık eden CRISPR lokusunda bulunan kök döngü mimarisini tanır . CRISPR RNA (crRNA) ve trans-aktive edici crRNA (tracrRNA) ile kompleks halindeki Cas9, hedef dsDNA'yı daha da tanır ve bozar. Burada gösterilen ortak kristal yapıda, crRNA-tracrRNA kompleksi, doğal RNA kompleksi ile aynı işleve sahip olduğu kanıtlanmış, kimerik tek kılavuzlu bir RNA (kırmızı renkte sgRNA) ile değiştirilir . Hedef ssDNA ile eşleştirilen sgRNA bazı, Cas9 tarafından T-şekilli bir mimari olarak sabitlenir. DNA'ya bağlı Cas9 enziminin bu kristal yapısı, nükleaz lobuna ve ayrıca HNH bölgesinin konumuna göre alfa sarmal lobda belirgin konformasyonel değişiklikleri ortaya çıkarır. Protein, bir tanıma lobu (REC) ve bir nükleaz lobundan (NUC) oluşur. HNH dışındaki tüm bölgeler birbirleriyle ve sgRNA-ssDNA kompleksiyle sıkı etkileşimler oluştururken, HNH alanı proteinin geri kalanıyla birkaç temas oluşturur. Kristalde gözlenen Cas9 kompleksinin başka bir konformasyonunda, HNH alanı görünmez. Bu yapılar, HNH alanının konformasyonel esnekliğini önerir.

Bugüne kadar en az üç kristal yapı incelenmiş ve yayınlanmıştır. Biri apo durumunda Cas9'un bir yapısını temsil ediyor ve ikisi DNA'ya bağlı durumda Cas9'u temsil ediyor.

sgRNA ile etkileşimler

CRISPR/Cas9

sgRNA-Cas9 kompleksinde, kristal yapıya dayalı olarak, REC1, BH ve PI alanları, hem tekrar hem de boşluk bölgesinde omurga veya bazlarla önemli temaslara sahiptir. REC1 veya REC2 alan silme ve BH'deki kalıntı mutasyonları dahil olmak üzere birkaç Cas9 mutantı test edilmiştir. REC1 ve BH ile ilgili mutantlar, vahşi tip ile karşılaştırıldığında daha düşük aktivite gösterir veya hiç aktivite göstermez; bu, bu iki alanın, tekrar dizisinde sgRNA tanıma ve tüm kompleksin stabilizasyonu için çok önemli olduğunu gösterir. Aralayıcı dizi ve Cas9 arasındaki etkileşimlerin yanı sıra PI alanı ve tekrar bölgesi arasındaki etkileşimler daha fazla çalışmaya ihtiyaç duysa da, ortak kristal Cas9 ve sgRNA arasında net bir arayüz gösterir.

DNA bölünmesi

Önceki dizi analizi ve biyokimyasal çalışmalar, Cas9'un iki nükleaz alanı içerdiğini ortaya koydu: bir McrA benzeri HNH nükleaz alanı ve bir RuvC benzeri nükleaz alanı. Bu HNH ve RuvC benzeri nükleaz alanları, sırasıyla tamamlayıcı/hedef ve tamamlayıcı olmayan/hedef olmayan DNA zincirlerinin bölünmesinden sorumludur. Düşük dizi benzerliğine rağmen, RNase H'ye benzer dizi bir RuvC katına (RNase H ailesinin bir üyesi) sahiptir ve HNH bölgesi T4 Endo VII (HNH endonükleaz ailesinin bir üyesi) olarak katlanır.

Yabani tip S. pyogenes Cas9 , RNA aracılı DNA bölünmesi için magnezyum (Mg 2+ ) kofaktörleri gerektirir ; bununla birlikte, Cas9'un diğer iki değerlikli metal iyonlarının mevcudiyetinde değişen seviyelerde aktivite sergilediği gösterilmiştir . Örneğin, manganez (Mn2 + ) varlığında Cas9'un RNA'dan bağımsız DNA bölünmesi yapabildiği gösterilmiştir. Kinetik bu veri reaksiyonun inceliklerini içine açıklayıcı bilgi verir Cas9 tarafından DNA parçalanmasının, bilim dünyasında büyük ilgi olmuştur. DNA'nın RNA'ya bağlı Cas9 tarafından bölünmesinin nispeten hızlı olduğu gösterilmiş olsa da ( k ≥ 700 s -1 ), bölünme ürünlerinin salınımı çok yavaştır ( t 1/2 = ln(2)/ k ≈ 43- 91 saat), esas olarak Cas9 bir tek işleme devir enzim. Cas9'un kinetiği ile ilgili ek çalışmalar, tasarlanmış Cas9'un reaksiyon hızını değiştirerek hedef dışı etkileri azaltmada etkili olduğunu göstermiştir .

Bakterilerin Cas9 düzenlemesine neden olduğu sorunlar

Çoğu arke ve bakteri, bir Cas9'un genomlarını düzenlemesine izin vermeyi inatla reddediyor. Bunun nedeni, kendilerini etkilemeyen yabancı DNA'yı genomlarına bağlayabilmeleridir. Bu hücrelerin Cas9'a meydan okumasının bir başka yolu, kısıtlama modifikasyonu (RM) sistemi sürecidir. Bir bakteriyofaj bir bakteri veya arke hücresine girdiğinde RM sistemi tarafından hedef alınır. RM sistemi daha sonra bakteriyofaj DNA'sını kısıtlama enzimleri ile ayrı parçalara ayırır ve DNA ipliklerini daha fazla yok etmek için endonükleazları kullanır. Bu, Cas9 düzenlemesi için bir sorun teşkil eder, çünkü RM sistemi, Cas9 işlemi tarafından eklenen yabancı genleri de hedef alır.

Cas9'un transkripsiyon ayarına uygulamaları

dCas9 tarafından transkripsiyon girişimi

Cas9'un herhangi bir genomdaki herhangi bir tamamlayıcı sekansa bağlanma konusundaki benzersiz yeteneği nedeniyle , araştırmacılar bu enzimi çeşitli genomik lokusların transkripsiyonunu bastırmak için kullanmak istediler . Bunu başarmak için, RuvC ve HNH bölgesinin iki önemli katalitik tortusu, Cas9'un tüm endonükleaz aktivitesini ortadan kaldıran alanine mutasyona uğratılabilir. Kısaca 'ölü' Cas9 veya 'dCas9' olarak adlandırılan sonuçtaki protein, yine de dsDNA'ya sıkı bir şekilde bağlanabilir. Bu katalitik olarak aktif olmayan Cas9 varyantı, hem Cas9 DNA sorgulayıcı bağlanmasına yönelik mekanik çalışmalarda hem de genel bir programlanabilir DNA bağlayıcı RNA-Protein kompleksi olarak kullanılmıştır.

DCas9'un hedef dsDNA ile etkileşimi o kadar sıkıdır ki, yüksek molariteye sahip üre proteini denatüran, dCas9 RNA-protein kompleksini dsDNA hedefinden tam olarak ayıramaz. dCas9, dCas9'un transkripsiyonu durdurmak için promotörlerde RNA polimeraz ile rekabet edebileceği herhangi bir lokusun transkripsiyon başlatma bölgelerine yönelik tasarlanmış tek kılavuz RNA'larla hedeflenmiştir. Ayrıca, dCas9, transkripsiyonun uzama fazı sırasında RNA Polimerazın inhibisyonu meydana gelecek şekilde lokusların kodlama bölgesine hedeflenebilir. Ökaryotlarda, gen ekspresyonunun susturulması, dCas9'un spesifik gen ekspresyonunun susturulmasına yol açan transkripsiyon faktörlerinin montajını bloke edebildiği güçlendirici dizilere hedeflenerek genişletilebilir. Ayrıca, dCas9'a sağlanan kılavuz RNA'lar, dCas9'un programlanmış aynı kökenli dizisi için etkileşimini nicel olarak zayıflatacak tamamlayıcı ortak kökenli dizisine spesifik uyumsuzluklar içerecek şekilde tasarlanabilir ve bir araştırmacının ilgili bir gene uygulanan gen susturma derecesini ayarlamasına olanak tanır. Bu teknoloji prensipte RNAi'ye benzer, öyle ki gen ekspresyonu RNA seviyesinde modüle edilir. Bununla birlikte, RNAi ekranlarına kıyasla dCas9 kullanımı yoluyla daha az hedef dışı efekt ve genel olarak daha büyük ve daha fazla tekrarlanabilir susturma etkileri olduğu için dCas9 yaklaşımı daha fazla çekiş kazanmıştır. Ayrıca, gen susturma için dCas9 yaklaşımı nicel olarak kontrol edilebildiği için, bir araştırmacı artık gen regülasyonu ve gen stokiyometrisi hakkında daha fazla sorunun yanıtlanmasına izin vererek ilgilenilen bir genin ne ölçüde bastırıldığını tam olarak kontrol edebilir .

DCas9'un lokusların transkripsiyonel olarak hassas pozisyonlarına doğrudan bağlanmasının ötesinde, dCas9, sayısız işlevi yerine getirmek için çeşitli modülatör protein alanlarına kaynaştırılabilir. Son zamanlarda, dCas9 kaynaştırılmış olduğu kromatin çeşitli mahallere çevresinde kromatin yapısının yeniden düzenlemek için proteinler (HDAC'ler / şapkalar) biçimlenme. Bu, heterokromatin yapıları Cas9 bağlanmasını engellediğinden, ilgili çeşitli ökaryotik genleri hedeflemede önemlidir. Ayrıca, Cas9 heterokromatine tepki gösterebildiğinden , bu enzimin çeşitli lokusların kromatin yapısını incelemek için daha fazla uygulanabileceği teorize edilmiştir. Ek olarak, dCas9, gen baskısının genom geniş ekranlarında kullanılmıştır. Binlerce geni hedefleyebilen büyük kılavuz RNA kitaplıkları kullanılarak, dCas9 kullanılarak genom çapında genetik taramalar gerçekleştirilmiştir.

Cas9 ile transkripsiyonu susturmak için başka bir yöntem, mRNA ürünlerini katalitik olarak aktif Cas9 enzimi ile doğrudan parçalamaktır. Bu yaklaşım, Cas9 bağlanması için bir dsDNA-RNA PAM sahasına izin veren bir PAM tamamlayıcı dizisi ile ssDNA'nın ssRNA'ya hibridize edilmesiyle mümkün kılınır. Bu teknoloji, RNA veya RNA etiketleme yöntemlerinde kimyasal modifikasyonların indüklenmesine gerek kalmadan hücrelerde endojen RNA transkriptlerini izole etme yeteneğini sağlar.

DCas9 füzyon proteinleri tarafından transkripsiyon aktivasyonu

Susturma genlerinin aksine, dCas9, transkripsiyon aktive edici faktörlere kaynaştığında genleri aktive etmek için de kullanılabilir. Bu faktörler, bakteriyel RNA Polimeraz II'nin alt birimlerini ve ökaryotlardaki geleneksel transkripsiyon faktörlerini içerir. Son zamanlarda, aktivasyon için 'CRISPRa' adlı dCas9 füzyonları kullanılarak genom çapında transkripsiyon aktivasyon ekranları da gerçekleştirilmiştir.

Ayrıca bakınız

Referanslar

daha fazla okuma

Dış bağlantılar

  • Uygun yapısal bilginin her genel PDB için Uniprot : Q99ZW2 (Streptococcus pyogenes Cas9 / Csn1 endonükleaz CRISPR ile ilgili) de PDBe-KB .