paleogenomik - Paleogenomics
Paleogenomik , soyu tükenmiş türlerdeki genomik bilgilerin yeniden yapılandırılması ve analizine dayanan bir bilim alanıdır . Müze eserlerinden, buz çekirdeklerinden, arkeolojik veya paleontolojik alanlardan antik DNA'nın (aDNA) çıkarılması için geliştirilmiş yöntemler ve yeni nesil dizileme teknolojileri bu alanı teşvik etti. Artık genetik sürüklenmeyi , eski nüfus göçlerini ve aralarındaki ilişkileri, soyu tükenmiş bitki, hayvan ve Homo türlerinin evrimsel tarihini ve coğrafi bölgelerdeki fenotipik özelliklerin tanımlanmasını tespit etmek mümkün. Bilim adamları ayrıca eski ataları günümüz insanlarıyla karşılaştırmak için paleogenomik kullanabilirler.
Arka plan
Başlangıçta, aDNA dizilemesi, aDNA'nın bin yıl boyunca maruz kaldığı oksidatif hasar nedeniyle düşük verimlilikle ilerleyen küçük fragmanların bakterilere klonlanmasını içeriyordu. aDNA'nın nükleazlar tarafından kolay bozunması nedeniyle analiz edilmesi zordur ; belirli ortamlar ve ölüm sonrası koşullar iyileştirilmiş izolasyon ve analiz. Güvenilir analizler için ekstraksiyon ve kontaminasyon protokolleri gerekliydi. 1983'te Polimeraz Zincir Reaksiyonunun ( PCR ) geliştirilmesiyle, bilim adamları, nispeten kısa izole edilmiş fragmanların bir sınırlaması olarak, yaklaşık 100.000 yaşına kadar olan DNA örneklerini inceleyebildiler. İzolasyon, amplifikasyon, sıralama ve veri yeniden oluşturmadaki gelişmeler sayesinde, daha eski ve daha eski örnekler analiz edilebilir hale geldi. Son 30 yılda, yüksek kopya sayısına sahip mitokondriyal DNA birçok soruyu yanıtlayabildi; NGS tekniklerinin ortaya çıkışı çok daha fazlasını teşvik etti. Üstelik bu teknolojik devrim, paleogenetikten paleogenomiğe geçişi sağladı.
Sıralama yöntemleri
Zorluklar ve teknikler
aDNA dizilemesi için birçok biyoinformatik aracının yanı sıra PCR , NGS ikinci nesil ve çeşitli kütüphane yöntemleri mevcuttur . Bu yöntemlerin her biri ile uğraşırken aDNA'nın ölümden sonra değiştirilebileceğini düşünmek önemlidir. Spesifik değişiklikler şunlardan kaynaklanır:
- Temel mutasyon kalıpları dizi verileri (C->T mutasyonu)
- Çapraz bağlantılar
- Sitozin deaminasyonu (okuma terminisine doğru arttı)
- depurinasyon
- genom parçalanması
Spesifik modeller ve bu değişikliklerin başlangıcı, bilim adamlarının numunenin yaşını tahmin etmelerine yardımcı olur.
Eskiden bilim adamları, enzimatik reaksiyonlar veya kütle spektroskopisi ile bağlantılı gaz kromatografisi kullanarak ölüm sonrası hasarları teşhis ederdi ; daha yakın yıllarda bilim adamları, mutasyon dizilimi verilerinden yararlanarak bunları tespit etmeye başladılar. Bu strateji, urasil DNA glikosilaz ile tedaviyi takiben fazla C->T mutasyonlarının belirlenmesine izin verir . Günümüzde, kullanımları , yüksek verimli sekanslama (HTS) (genç numuneler daha fazla ortaya bir işlem sürücülere, ölüm sonrası, DNA parçalanma depurinasyon tespit etmek adenin daha guanin ), tek kordonlu kırılmaları DNA ve abazik site çift sarmal (C- tarafından oluşturulan >T mutasyonu).
Tek bir aDNA parçası, HTS ile tüm uzunluğu boyunca dizilenebilir. Bu verilerle, numuneler arasında uzay ve çevre koşulları yoluyla parçalanmanın doğrudan nicel karşılaştırmasını sağlayan bir boyut bozulma eğrisini temsil eden bir dağılım oluşturabiliriz. Bozunma eğrisi boyunca, verilen aDNA fragmanının medyan uzunluğunu elde etmek mümkündür. Bu uzunluk, genellikle çökelme sıcaklığı ile artan ölümden sonraki parçalanma seviyelerini yansıtır.
Kütüphaneler
Genom amplifikasyonu için PCR kullanılarak aDNA dizilemesi için iki farklı kitaplık gerçekleştirilebilir :
- Çift sarmallı aDNA kitaplığı (dsDNA kitaplığı)
- Tek sarmallı aDNA kitaplığı (ssDNA kitaplığı)
İlki, kör uç yaklaşımı kullanılarak oluşturulur. Bu teknik iki farklı bağdaştırıcı kullanır: bu bağdaştırıcılar parçayı rastgele bağlar ve daha sonra amplifiye edilebilir. Her iki bağdaştırıcıyı içermeyen parça, bir hata kaynağına neden olacak şekilde yükseltilemez. Bu hatayı azaltmak için, Illumina T/A ligasyonu tanıtıldı: bu yöntem, T kuyruklu adaptörlerin ligasyonunu kolaylaştırmak için DNA örneğine A kuyruğunun sokulmasını içerir. Bu yöntemlerde aDNA'nın amplifikasyonunu optimize ediyoruz.
ssDNA kitaplıkları elde etmek için, DNA önce ısı ile denatüre edilir. Elde edilen ssDNA daha sonra tamamlayıcı ipliği oluşturmak için iki adaptöre bağlanır ve son olarak PCR uygulanır.
aDNA Zenginleştirme
aDNA, bakteri DNA'sı veya başka mikroorganizmalar içerebileceğinden, süreç zenginleştirmeyi gerektirir. İçsel ve dışsal fraksiyonları ayırmak için çeşitli yöntemler kullanılır:
- Hasarlı şablon zenginleştirme: Bu yöntem DNA hasarını hedeflediğinden bir ssDNA kitaplığı oluştururken kullanılır. Bst polimeraz çentiği doldurduğunda, numune urasil DNA glikosilaz ve endonükleaz VIII ile işlenir. Bu bileşikler abazik bölgeye saldırır. Hasar görmemiş DNA, streptavidin kaplı paramanyetik boncuklara bağlı kalır ve numuneden ayrılabilir. Bu yöntem, geç Pleistosen Neandertallerinden alınan örnekler için özeldir.
- Çözümde uzantısız hedef zenginleştirme: Bu yöntem, hedef-sonda hibridizasyonuna dayanmaktadır. Bu yöntem, DNA denatürasyonu gerektirir ve ardından hedef bölgeler boyunca örtüşen kiremitli problar ekler. Ardından, DNA amplifikasyonu için PCR kullanılır ve son olarak DNA, biyotinlenmiş bir adaptöre bağlanır . Arkaik hominin soyundan gelen örnekler için kullanışlıdır.
- Katı fazlı hedef zenginleştirme: Bu yöntemde shotgun dizileme taramasına paralel olarak mikroarray ve real-time PCR yöntemi kullanılmaktadır .
- Tüm genom zenginleştirme: Tek bireylerin tüm genomunu sıralamak için kullanılır. Tüm genom Çözüm İçi Yakalama (WISC) kullanılır. Bu yöntem, DNA örneğindeki hedef genomla yakından ilişkili bir genomu olan bir türden genom çapında bir RNA prob kütüphanesinin hazırlanmasıyla başlar.
Günümüzün Afrikalı olmayan popülasyonlarının ve anatomik olarak modern insanların çeşitlendirilmesi
Şimdiye kadar farklı alanlarda yapılan birçok çalışma, günümüzün Afrikalı olmayan popülasyonunun, Afrika dışı bir ana karakter olan atalardan kalma, iyi yapılandırılmış bir metapopülasyonun birkaç farklı soyundaki çeşitliliğin sonucu olduğu sonucuna varmıştır. Afrika genetik mirasının bir alt kümesini taşıdığı genişleme . Bu bağlamda, eski DNA'nın analizi, halihazırda formüle edilmiş hipotezi test etmek ve yeni anlayışlar sağlamak için temeldi. İlk olarak, otozomal ve mitokondriyal mutasyon oranının kalibrasyonunu sağlayarak bu çeşitlenme olgusunun zamanlamasını ve yapısını daraltmaya olanak sağlamıştır . Katkı analizi, modern insanların ataları ile Neandertal ve Denisovan popülasyonları gibi arkaik insanlar arasında en az iki bağımsız gen akışı olayının meydana geldiğini ve Avrasya insan popülasyon tarihinin “sızdıran yer değiştirme” modelini doğruladığını göstermiştir. 55.000 - bu veriler tüm göre, Afrikalı olmayan soy insan sapma etrafında 45,000 oluştu BP . Bunun yanı sıra, birçok durumda, antik DNA, zaman içinde, yalnızca günümüz genomlarının analizine dayanarak yapılması zor olan gerçek popülasyon genetik yapısına yol açan tarihsel süreçlerin izlenmesine izin vermiştir. Bu hala çözülmemiş sorular arasında, en çok çalışılanlardan bazıları Amerika'nın ilk sakinlerinin kimliği, Avrupa'nın nüfusu ve Avrupa'da tarımın kökenidir.
İnsanlarda fenotipik varyasyon
Antik DNA'nın analizi, çevre ve insan davranışındaki değişiklikleri takiben fenotipik özelliklerin mutasyonlarını incelemeye izin verir . Yeni habitatlara göç, yeni beslenme değişiklikleri (tarıma geçişi takiben) ve büyük toplulukların inşası, insanların nihayetinde biyolojik adaptasyonla sonuçlanan yeni koşullara maruz kalmasına yol açtı .
Ten rengi
İnsanların Afrika'dan daha yüksek enlemlere göçü, güneş ışığına daha az maruz kalmayı gerektiriyordu. Yana UVA ve UVB ışınları sentezi için önemli olan D vitamini , kalsiyum emilimini düzenler ve böylece kemik sağlığı için gerekli olan yüksek enlemlerde yaşayan bir azalma anlamına gelecektir D vitamini sentezi. Bu , daha yüksek enlemlerde daha açık ten rengini tercih ederek ten rengi özelliği üzerinde yeni bir seçici baskı oluşturdu. Cilt pigmentasyonunda yer alan en önemli iki gen SLC24A5 ve SLC45A2'dir. Günümüzde bu genlerin "açık tenli" alelleri Avrupa'da sabittir, ancak nispeten yüksek bir frekansa ancak oldukça yakın bir zamanda (yaklaşık 5000 yıl önce) ulaştılar. Bu kadar yavaş depigmentasyon süreci, eski Avrupalıların kas-iskelet sistemi ve kardiyovasküler rahatsızlıklar gibi düşük D vitamini üretiminin olumsuz yanlarıyla karşılaşmış olabileceğini düşündürmektedir. Diğer bir hipotez ise, tarım öncesi Avrupalıların D vitamini gereksinimlerini diyetleri yoluyla karşılayabilecekleridir (çünkü et ve balık bir miktar D vitamini içerir).
Tarımsal diyete uyum
Tarımsal diyete geçişi izleyen en önemli adaptasyon örneklerinden biri , yetişkinlikte laktaz enziminin üretiminin devam etmesidir . Bu enzim, süt ve diyet ürünlerinde bulunan laktozu sindirmek için gereklidir ve yokluğu, bu ürünlerin tüketilmesinden sonra ishale yol açar. Laktaz kalıcılığı, ağırlıklı olarak MCM6 genindeki tek bazlı bir mutasyon tarafından belirlenir ve eski DNA verileri, bu mutasyonun yalnızca son 5000 yıl içinde, sütçülük uygulamalarının başlamasından binlerce yıl sonra yaygın hale geldiğini göstermektedir. Bu nedenle, laktaz kalıcılığı durumunda bile, yeni bir alışkanlığın başlaması ile adaptif alelin yayılması arasında büyük bir zaman gecikmesi vardır ve bu nedenle süt tüketimi çocuklarla veya laktozu azaltılmış ürünlerle sınırlandırılmış olabilir.
Tarıma geçişle pozitif olarak seçilen bir başka mutasyon örneği de AMY1 gen kopyalarının sayısıdır. AMY1 , tükürükte bulunan nişasta sindirici enzim amilazını kodlar ve modern insanlarda şempanzelere kıyasla daha fazla sayıda gen kopyası bulunur .
Bağışıklık sistemi
İnsan bağışıklık sistemi , binlerce yıl boyunca farklı patojen ortamlarına uyum sağlayarak yoğun bir seçimden geçti. Çeşitli çevresel ve kültürel değişiklikler , farklı bağışıklıkla ilişkili genler üzerinde seçici bir baskı uyguladı . Örneğin göçler, insanları yeni patojenler veya patojen vektörler (örneğin sivrisinekler) taşıyan yeni habitatlara maruz bıraktı. Ayrıca tarıma geçiş, hem artan nüfus yoğunluğu hem de hayvancılığa yakın yaşama nedeniyle farklı patojenlere ve sağlık koşullarına maruz kalmayı içeriyordu. Bununla birlikte, belirli antik genom değişiklikleri ile belirli patojenlere karşı geliştirilmiş direnç arasında doğrudan ilişki kurmak zordur, bu da insan bağışıklık sisteminin genişliğini ve karmaşıklığını verir. İnsan bağışıklık sistemindeki doğrudan değişiklikleri incelemenin yanı sıra, tüberküloz , cüzzam , veba , çiçek hastalığı veya sıtmaya neden olanlar gibi eski patojenlerin genomlarını da incelemek mümkündür . Örneğin, araştırmacılar, 3600 yıl önce Yersinia pestis'in tüm suşlarının , patojenin pire bağırsağında hayatta kalması için gerekli olan ymt geninden yoksun olduğunu keşfettiler . Bu, geçmişteki vebanın daha yakın tarihli Y. pestis salgınlarına kıyasla daha az öldürücü olabileceğini düşündürmektedir .
Bitkiler ve hayvanlar
İnsansı olmayan birçok omurgalı - eski mamut , kutup ayısı , köpek ve at - düşük sıcaklıkta veya yüksek irtifada korunan fosillerden ve örneklerden aDNA geri kazanımı yoluyla yeniden yapılandırıldı . Mamut çalışmaları, permafrosttan gelen yüksek yumuşak doku ve saç varlığı nedeniyle en sık yapılır ve daha yeni fillerle olan ilişkiyi ve demografik değişiklikleri belirlemek için kullanılır . Kutup ayısı çalışmaları üzerindeki etkisini saptamak için yapılır iklim değişikliği içinde evrim ve biyolojik çeşitlilik . Köpek ve at çalışmaları evcilleştirmeye ilişkin içgörüler sağlar . Bitkilerde, aDNA tohumlardan , polenden ve odundan izole edilmiştir . Antik ve mevcut arpa arasında bir ilişki tespit edilmiştir . Diğer bir uygulama ise, kuraklık toleransı ve şeker içeriği için genleri içeren mısırın evcilleştirme ve adaptasyon sürecinin tespitiydi .
Zorluklar ve gelecek perspektifleri
Anatomik olarak modern insanların antik genomlarının analizi, son yıllarda nüfus göçlerini, dönüşümlerini ve evrimini inceleme yöntemimizde tamamen devrim yarattı. Bununla birlikte, hala çok şey bilinmiyor. Kadim DNA ekstraksiyon tekniklerinin sürekli iyileştirilmesiyle kısmen üstesinden gelinecek olan bu tür bir yaklaşımla ilgili ilk ve bariz sorun, özellikle Afrika'da ve Afrika'da gözlemlenen bir zorluk olan iyi korunmuş antik genomları kurtarmanın zorluğudur. Sıcaklıkların dünyanın diğer soğuk bölgelerinden daha yüksek olduğu Asya. Ayrıca Afrika, tüm kıtalar arasında en fazla genetik çeşitliliği barındıran kıtadır . DNA bozulmasının yanı sıra, eksojen kontaminasyon da paleogenomik dizileme ve montaj işlemlerini sınırlar. O zamandan gelen antik DNA'ya ve günümüzün Afrikalı olmayan nüfusunun orijinal atalarının yaşadığı bölgeye sahip olmadığımız için, yapıları ve konumları hakkında hala çok az şey biliyoruz. Bu konunun yüzleşmesi gereken ikinci ve daha önemli zorluk, erken modern insanlardan (100.000 – 200.000 BP) DNA'nın geri kazanılmasıdır. Bu veriler, analiz edilecek çok sayıda arkaik genomla ve arkaik genetik karışımın zamanlaması ve dağılımına ilişkin bilgiyle birlikte, bilim adamlarının türümüzün tarihini daha kolay yeniden yapılandırmasına olanak sağlayacaktır. Aslında, genetik tarih hakkında daha fazla veri toplamak, insanın evrimini sadece göçler ve doğal seleksiyon açısından değil, aynı zamanda kültür açısından da izlememizi sağlayacaktır . Önümüzdeki on yılda paleogenomik araştırma alanı, dikkatini temel olarak üç konuya odaklayacaktır: daha yoğun örnekleme yoluyla geçmiş insan etkileşimlerinin ince ölçekli bir ayrıntıyla tanımlanması, bu etkileşimlerin tarımsal geçişe nasıl katkıda bulunduğunun anlaşılması. Üzerinde çalışılmamış bölgelerin DNA'sı ve son olarak, günümüz fenotiplerine doğal seçilimin katkısının nicelleştirilmesi. Tüm bu verileri yorumlamak için genetikçilerin, daha önce antropologlar ve arkeologlarla , tarihçilerle yaptıkları gibi, işbirliği yapmaları gerekecektir .
biyoetik
Palleogenomikte biyoetik , bilim adamları, hükümetler ve yerli halklar arasındaki karmaşık ilişkilerden dolayı eski insan kalıntılarının incelenmesinde ortaya çıkan etik sorularla ilgilidir . Ek olarak, paleogenomik çalışmalar, topluluğa veya bireysel tarihlere ve kimliklere zarar vermenin yanı sıra, onların soyundan gelenler hakkında kınayan bilgileri ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir. Bu nedenlerle, bu tür çalışmalar hala hassas bir konudur. Paleogenomik çalışmalar, temel olarak etik ilkelerin ve uygulamaların ifadeleri arasındaki tutarsızlıklar nedeniyle olumsuz sonuçlar doğurabilir. Aslında, ataların kalıntıları genellikle yasal ve bilimsel olarak “insan denekler” yerine “eserler” olarak kabul edilir, bu da şüpheli davranışları ve toplulukların katılım eksikliğini haklı çıkarır . Ataların kalıntılarının test edilmesi bu nedenle anlaşmazlıklarda, anlaşmadaki iddialarda, ülkeye geri gönderilmede veya diğer yasal davalarda kullanılır. Bu konunun öneminin ve duyarlılığının kabulü, atadan kalma kalıntıların itibarını korumak ve etik sorunlardan kaçınmak için farklı bağlamlara uygulanabilir etik taahhüt ve rehberliğe doğru gidiyor. Son olarak, bir başka öncü ilgi alanı, mamut gibi soyu tükenmiş türlerin yeniden diriltilmesini amaçlayan sözde "neslinin yok edilmesi" projesidir. CRISPR/Cas9 teknolojisi sayesinde mümkün görünen bu proje, ancak birçok etik sorunla güçlü bir şekilde bağlantılı.