transkriptom - Transcriptome

Transkriptom tüm dizi RNA kodlama dahil transkript, kodlayıcı olmayan bir birey veya bir popülasyonda, hücreler . Terim bazen belirli deneye bağlı olarak tüm RNA'ları veya sadece mRNA'yı belirtmek için de kullanılabilir . Transkriptom terimi , transkript ve genom kelimelerinin bir birleşimidir ; biyolojik transkripsiyon süreci sırasında transkript üretim süreci ile ilişkilidir .

Transkriptom ek açıklamalarının ilk aşamaları , 1980'lerde yayınlanan cDNA kitaplıklarıyla başladı . Daha sonra, yüksek verimli teknolojinin ortaya çıkışı, transkriptome hakkında veri elde etmenin daha hızlı ve daha verimli yollarına yol açtı. Transkriptomu incelemek için iki biyolojik teknik kullanılır, yani hibridizasyon tabanlı bir teknik olan DNA mikrodizisi ve dizi tabanlı bir yaklaşım olan RNA-seq . RNA-seq tercih edilen yöntemdir ve 2010'lardan beri baskın transkriptomik teknik olmuştur. Tek hücreli transkriptomik , tek tek hücreler içinde zaman içinde transkript değişikliklerinin izlenmesini sağlar.

Transkriptomdan elde edilen veriler , diğerlerinin yanı sıra hücresel farklılaşma , karsinojenez , transkripsiyon düzenlemesi ve biyobelirteç keşfi gibi süreçler hakkında fikir edinmek için araştırmalarda kullanılır . Transkriptomdan elde edilen veriler , evrim sürecinde ve in vitro fertilizasyon sırasında filogenetik ilişkilerin kurulmasında da uygulama bulur . Transkriptom, diğer -ome bazlı biyolojik çalışma alanlarıyla yakından ilişkilidir ; Bu tamamlayıcı olan proteomu ve metabolom ve şunları kapsar translatome , exome , meiome ve thanatotranscriptome RNA transkriptlerinin belirli tipleri üzerinde araştırma ome alanları olarak görülebilen. Halka açık çok sayıda transkriptome veri tabanı vardır.

Etimoloji ve tarih

Transkriptom kelimesi , transkript ve genom kelimelerinin bir birleşimidir . Yaşam bilimleri ve teknoloji alanlarında genom çapında yürütülen tüm çalışmaları belirtmek için -ome ve -omik sonekleri kullanılarak oluşturulan diğer neolojizmlerle birlikte ortaya çıktı . Bu nedenle, transkriptom ve transkriptomik, genom ve proteom ile birlikte ortaya çıkan ilk kelimelerden biriydi. İpek güvesi mRNA'sı için bir cDNA kütüphanesi koleksiyonu vakasını sunan ilk çalışma 1979'da yayınlandı. Bir organizmanın transkriptomundan bahseden ve araştıran ilk ufuk açıcı çalışma 1997'de yayınlandı ve S. cerevisiae'de ifade edilen 60.633 transkript tanımladı. gen ekspresyonunun (SAGE) seri analizini kullanarak . Yüksek verimli teknolojilerin ve biyoinformatiğin yükselişi ve ardından artan hesaplama gücü ile, muazzam miktarda veriyi karakterize etmek ve analiz etmek giderek daha verimli ve kolay hale geldi. Transkriptomu karakterize etme girişimleri, 1980'lerde otomatik DNA dizilemesinin ortaya çıkmasıyla daha belirgin hale geldi. 1990'larda, genleri ve parçalarını tanımlamak için eksprese edilmiş dizi etiketi dizilimi kullanıldı. Bunu, gen ekspresyonunun seri analizi (SAGE), gen ekspresyonunun kap analizi (CAGE) ve büyük ölçüde paralel imza dizilimi (MPSS) gibi teknikler izledi .

Transkripsiyon

Transkriptom, belirli bir organizmada veya deneysel numunede bulunan tüm ribonükleik asit (RNA) transkriptlerini kapsar . RNA, DNA'yı bir organizmanın fenotipine dönüştürme sürecinden sorumlu olan genetik bilginin ana taşıyıcısıdır . Bir gen, transkripsiyon olarak bilinen moleküler bir süreçle tek iplikli bir haberci RNA'ya (mRNA) yol açabilir ; bu mRNA, kaynaklandığı DNA sarmalının tamamlayıcısıdır. RNA polimeraz II enzimi , şablon DNA zincirine bağlanır ve mRNA transkriptinin büyüyen dizisinin 3' ucuna ribonükleotidlerin eklenmesini katalize eder.

İşlevini başlatmak için RNA polimeraz II'nin , genin yukarı akışında (5') bulunan bir promotör dizisini tanıması gerekir . Ökaryotlarda, bu sürece, transkripsiyon faktörleri aracılık eder , en önemlisi , TATA kutusunu tanıyan ve RNA polimerazın uygun başlangıç ​​bölgesinde konumlandırılmasına yardımcı olan Transkripsiyon faktörü II D (TFIID) . RNA transkriptinin üretimini bitirmek için, sonlandırma genellikle sonlandırma dizisinden birkaç yüz nükleotit uzakta gerçekleşir ve bölünme gerçekleşir. Bu işlem, bir hücrenin çekirdeğinde, mRNA moleküllerinin daha sonra sitoplazmaya alınmadan önce stabilitelerini artırmak için kapatıldığı , eklendiği ve poliadenillendiği RNA işlemesi ile birlikte gerçekleşir . MRNA işlemi boyunca proteinlere neden olur çeviri yer alır ribozomlar .

RNA transkriptlerinin türleri

Moleküler biyolojinin merkezi dogmasına uygun olarak, transkriptom başlangıçta sadece protein kodlayan mRNA transkriptlerini kapsıyordu. Bununla birlikte, farklı işlevlere sahip birkaç RNA alt tipi mevcuttur. Birçok RNA transkripti, protein kodlamaz veya gen transkripsiyonu ve translasyonu sürecinde farklı düzenleyici fonksiyonlara sahiptir. Kapsamına girmemektedir RNA türleri , moleküler biyoloji, merkezi dogma olan kodlayıcı olmayan RNA'lar , iki gruba ayrılabilir uzun kodlayıcı olmayan RNA ve kısa kodlayıcı olmayan RNA.

Uzun kodlamayan RNA, 200'den fazla nükleotit uzunluğundaki tüm kodlamayan RNA transkriptlerini içerir. Bu grubun üyeleri, kodlamayan transkriptomun en büyük bölümünü oluşturur. Kısa kodlamayan RNA aşağıdaki üyeleri içerir:

Çalışmanın kapsamı

İnsan genomunda, tüm genlerin yaklaşık %5'i RNA'ya kopyalanır. Transkriptom, bütünlüğünün yaklaşık %1-4'ünü oluşturan kodlayıcı mRNA'dan ve genomun geri kalanını oluşturan ve protein oluşturmayan kodlamayan RNA'lardan oluşur. Daha karmaşık organizmalarda protein kodlamayan dizilerin sayısı artar.

Birkaç faktör, transkriptomun içeriğinin oluşturulmasını zorlaştırır. Bunlar, diğerleri arasında alternatif ekleme , RNA düzenleme ve alternatif transkripsiyon içerir. Ek olarak, transkriptom teknikleri, bir numunede belirli bir zaman noktasında meydana gelen transkripsiyonu yakalayabilir, ancak transkriptomun içeriği farklılaşma sırasında değişebilir. Transkriptomiklerin ana amaçları şunlardır: "mRNA'lar, kodlayıcı olmayan RNA'lar ve küçük RNA'lar dahil tüm transkript türlerini kataloglamak; genlerin transkripsiyonel yapısını başlangıç ​​bölgeleri, 5' ve 3' uçları, eklemeler açısından belirlemek. desenler ve diğer transkripsiyon sonrası modifikasyonlar ve geliştirme sırasında ve farklı koşullar altında her transkriptin değişen ekspresyon seviyelerini ölçmek için".

Terim, belirli bir organizmadaki toplam transkript grubuna veya belirli bir hücre tipinde bulunan spesifik transkript alt kümesine uygulanabilir. Belirli bir hücre dizisi için ( mutasyonlar hariç ) kabaca sabitlenen genomun aksine, transkriptom dış çevresel koşullara göre değişebilir. Hücredeki tüm mRNA transkriptlerini içerdiğinden, transkriptom , transkripsiyonel zayıflama gibi mRNA bozunma fenomenleri dışında, herhangi bir zamanda aktif olarak eksprese edilen genleri yansıtır . Transkriptomik çalışma ( ifade profili oluşturma , ek varyant analizi vb. içerir), belirli bir hücre popülasyonundaki RNA'ların ekspresyon seviyesini inceler, genellikle mRNA'ya odaklanır, ancak bazen tRNA'lar ve sRNA'lar gibi diğerlerini de içerir.

inşaat yöntemleri

Transkriptomik, bir diziler listesinin ("okuma") nesneye (genomdaki "transkriptler") atanmasını kapsayan nicel bilimdir. İfade gücünü hesaplamak için, her nesneye karşılık gelen okumaların yoğunluğu sayılır. Başlangıçta, transkriptomlar, eksprese edilmiş sekans etiketleri kütüphaneleri ve gen ekspresyonunun (SAGE) seri ve kap analizi kullanılarak analiz edildi ve incelendi .

Şu anda, iki ana transkriptomik teknik , DNA mikrodizilerini ve RNA-Seq'i içerir . Her iki teknik de RNA ekstraksiyon teknikleri aracılığıyla RNA izolasyonu , ardından diğer hücresel bileşenlerden ayrılmasını ve mRNA'nın zenginleştirilmesini gerektirir.

Transkriptom dizilerini çıkarmanın iki genel yöntemi vardır. Bir yaklaşım harita dizisi, ya organizmanın kendisinden (transkriptomu inceleniyor) ya da yakından ilişkili bir türün bir referans genomunu okur. Diğer yaklaşım, de novo transkriptome montajı , kısa dizi okumalarından doğrudan transkriptleri çıkarmak için yazılımı kullanır ve dizilenmemiş genomları olan organizmalarda kullanılır.

DNA mikrodizileri

İnsan ( sol ) ve fare ( sağ ) örneklerinde gen ekspresyonunu saptamak için kullanılan DNA mikrodizisi

İlk transkriptom çalışmaları, mikrodizi tekniklerine (DNA çipleri olarak da bilinir) dayanıyordu . Mikrodiziler, üzerinde "sondalar" olarak bilinen oligonükleotidlerin sıralandığı noktalara sahip ince cam katmanlardan oluşur ; her nokta bilinen bir DNA dizisi içerir.

Mikrodizi analizleri yapılırken, mRNA bir kontrol ve deneysel numuneden toplanır, ikincisi genellikle bir hastalığı temsil eder. İlgilenilen RNA, stabilitesini arttırmak için cDNA'ya dönüştürülür ve iki grup için genellikle yeşil ve kırmızı olmak üzere iki renkli floroforlarla işaretlenir . cDNA, çip üzerindeki oligonükleotidlerle hibritleştiği mikrodizinin yüzeyine yayılır ve taramak için bir lazer kullanılır. Mikrodizinin her noktasındaki flüoresans yoğunluğu, gen ekspresyonunun düzeyine karşılık gelir ve seçilen flüoroforların rengine bağlı olarak, numunelerden hangisinin ilgilenilen mRNA'nın daha yüksek düzeylerini sergilediği belirlenebilir.

Bir mikrodizi genellikle bilinen tüm genleri temsil etmek için yeterli sayıda oligonükleotit içerir; ancak mikrodiziler kullanılarak elde edilen veriler, bilinmeyen genler hakkında bilgi sağlamaz. 2010'larda, mikrodiziler neredeyse tamamen DNA dizilimine dayanan yeni nesil tekniklerle değiştirildi.

RNA dizilimi

RNA dizileme, yeni nesil bir dizileme teknolojisidir; bu nedenle sadece az miktarda RNA gerektirir ve genom hakkında önceden bilgi gerektirmez. RNA transkriptlerinin hem kalitatif hem de kantitatif analizine izin verir, ilki yeni transkriptlerin keşfedilmesine ve ikincisi bir numunedeki transkriptler için nispi miktarların bir ölçüsüne izin verir.

Herhangi bir biyolojik numunenin transkriptomlarını sıralamanın üç ana adımı, RNA saflaştırmasını, bir RNA veya cDNA kitaplığının sentezini ve kitaplığın dizilenmesini içerir. RNA saflaştırma işlemi, kısa ve uzun RNA'lar için farklıdır. Bu adımı genellikle DNA gibi kontaminantlardan veya numune işlemeyle ilgili teknik kontaminantlardan kaçınmak amacıyla RNA kalitesinin bir değerlendirmesi takip eder. RNA kalitesi, 260 nm'lik bir absorbans tepe noktası ile UV spektrometrisi kullanılarak ölçülür. RNA bütünlüğü, kantitatif olarak da oranını ve yoğunluğunu karşılaştırarak analiz edilebilir 28S RNA için RNA, 18S RNA Bütünlük sayısı (RIN) skoru bildirilmiştir. mRNA, ilgilenilen tür olduğundan ve toplam içeriğinin yalnızca %3'ünü temsil ettiğinden, RNA örneği, rRNA ve tRNA ve dokuya özgü RNA transkriptlerini çıkarmak için işlenmelidir.

Kısa cDNA fragmanları üretmek amacıyla kütüphane hazırlama aşaması, 50 ila 300 baz çifti uzunluğundaki transkriptlere RNA fragmantasyonu ile başlar . Parçalanma enzimatik (RNA endonükleazları ), kimyasal (trismagnezyum tuz tamponu, kimyasal hidroliz ) veya mekanik ( sonikasyon , nebulizasyon) olabilir. RNA şablonlarını cDNA'ya dönüştürmek için ters transkripsiyon kullanılır ve bunu elde etmek için, oligo-DT dahil, rastgele primerler kullanarak veya özel adaptör oligolarını bağlayarak üç hazırlama yöntemi kullanılabilir.

Tek hücreli transkriptomik

Transkripsiyon, tek hücreli transkriptomik ile tek tek hücreler düzeyinde de incelenebilir . Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), tek hücrelerin transkriptomunun analizine izin veren yeni geliştirilmiş bir tekniktir. Tek hücreli transkriptomik ile, ilgilenilen dokuyu oluşturan hücre tiplerinin alt popülasyonları da dikkate alınır. Bu yaklaşım, deneysel numunelerdeki değişikliklerin, numunede belirli bir hücre tipinin aşırı eksprese edilebileceği proliferasyonun aksine fenotipik hücresel değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemeye izin verir. Ek olarak, farklılaşma yoluyla hücresel ilerlemeyi değerlendirirken , ortalama ekspresyon profilleri, gelişim aşamalarından ziyade hücreleri yalnızca zamana göre sıralayabilir ve sonuç olarak belirli aşamalara özgü gen ekspresyon seviyelerindeki eğilimleri gösteremez. Tek hücreli transkriptomik teknikler, dolaşımdaki tümör hücreleri , katı tümörlerde kanser kök hücreleri ve memeli blastokistlerinde embriyonik kök hücreler (ESC'ler) gibi nadir hücre popülasyonlarını karakterize etmek için kullanılmıştır .

Tek hücreli transkriptomik için standartlaştırılmış teknikler olmamasına rağmen, birkaç adımın atılması gerekir. İlk adım, düşük ve yüksek verimli teknikler kullanılarak gerçekleştirilebilen hücre izolasyonunu içerir. Bunu bir qPCR adımı ve ardından ilgilenilen RNA'nın cDNA'ya dönüştürüldüğü tek hücreli RNAseq izler. Tek hücreli transkriptomiklerdeki daha yeni gelişmeler, ince doku dilimlerini kriyo-kesitleme ve her dilimde transkriptomu sıralama yoluyla doku ve hücre altı lokalizasyonun korunmasına izin verir. Başka bir teknik, ifade edildikleri her bir hücrenin uzamsal bilgisini korurken, tekli transkriptlerin mikroskop altında görselleştirilmesine izin verir.

analiz

Farklı hücre popülasyonlarında farklı şekilde eksprese edilen genlerin tanımlanmasına yardımcı olmak için bir dizi organizmaya özgü transkriptom veri tabanı oluşturulmuş ve açıklanmıştır.

RNA-seq , organizmaların transkriptomlarını ölçmek için tercih edilen yöntem olarak ortaya çıkıyor (2013), ancak daha eski DNA mikrodizi tekniği hala kullanılıyor. RNA-seq, uzun RNA'ları bir cDNA fragmanları kitaplığına dönüştürerek belirli bir genin transkripsiyonunu ölçer . cDNA fragmanları daha sonra yüksek verimli dizileme teknolojisi kullanılarak dizilenir ve daha sonra genlerin bir ekspresyon profilini oluşturmak için kullanılan bir referans genom veya transkriptom ile hizalanır.

Uygulamalar

memeliler

Kök hücrelerin ve kanser hücrelerinin transkriptomları, hücresel farklılaşma ve karsinogenez süreçlerini anlamaya çalışan araştırmacıların özellikle ilgisini çekmektedir . RNA-seq veya gen dizisi verilerini kullanan bir boru hattı, kök ve öncü hücrelerde meydana gelen genetik değişiklikleri izlemek için kullanılabilir ve eski hücre tipi ve olgun hücrelerden en az üç bağımsız gen ekspresyonu verisi gerektirir.

İnsan transcriptomes analizi oositler ve embriyolar erken dönemde embriyo gelişimini kontrol eden moleküler mekanizmalar ve sinyal yolları anlamak için kullanılır ve teorik olarak uygun hale getirilmesi güçlü bir araç olabilir embriyo seçimi de in vitro fertilizasyon gibi . In vitro fertilizasyon ve embriyo transferinde (IVT-ET) gebeliğin ilk üç ayında plasentanın transkriptom içeriğinin analizi, daha yüksek olumsuz perinatal sonuçlarla ilişkili genetik ekspresyon farklılıklarını ortaya çıkardı. Bu tür bir içgörü, uygulamayı optimize etmek için kullanılabilir. Transkriptom analizleri, süreçle ilişkili yaralanmaları azaltarak oositlerin dondurularak saklanmasını optimize etmek için de kullanılabilir.

Transkriptomik, ilaçların güvenliğini veya kimyasal risk değerlendirmesini değerlendirmede kullanım için biyobelirteç keşfinde ortaya çıkan ve sürekli büyüyen bir alandır .

Transkriptomlar, bireyler arasındaki filogenetik ilişkileri ortaya çıkarmak veya transkriptom korumasının evrimsel modellerini tespit etmek için de kullanılabilir .

Antisens transkripsiyon insidansını, çevredeki genlerle etkileşim yoluyla gen ekspresyonundaki rollerini ve farklı kromozomlardaki bolluklarını keşfetmek için transkriptom analizleri kullanıldı. RNA-seq, aynı genden kaynaklanan ancak farklı yapılara sahip RNA izoformlarının, transkriptlerin nasıl sınırlı genomlardan karmaşık fenotipler üretebileceğini göstermek için de kullanıldı.

Bitkiler

Bitki türlerinin evrimini ve çeşitlendirme sürecini incelemek için transkriptom analizi kullanılmıştır . 2014 yılında, 1000 Bitki Genom Projesi ailelerinden 1124 bitki türlerinin transcriptomes hangi tamamlanmıştır Viridiplantae , glaucophyta ve Rhodophyta dizildi. Protein kodlama dizileri daha sonra bitkiler arasındaki filogenetik ilişkileri ortaya çıkarmak ve evrim sürecinde çeşitlenme zamanlarını karakterize etmek için karşılaştırıldı . Olgun polende gen ekspresyonunu karakterize etmek ve ölçmek için transkriptom çalışmaları kullanılmıştır . Hücre duvarı metabolizması ve hücre iskeleti ile ilgili genlerin aşırı eksprese edildiği bulundu. Transkriptom yaklaşımları ayrıca, mikrospordan olgun polen tanelerine kadar değişen polenin farklı gelişim aşamaları boyunca gen ekspresyonundaki değişiklikleri izlemeye de izin verdi; ayrıca bu aşamalar Arabidopsis , pirinç ve tütün gibi farklı bitki türleri arasında da karşılaştırılabilir .

Diğer ome alanlarıyla ilişkisi

Genom , transkriptom, proteom ve metabolom ( lipidome ) arasındaki ilişkileri gösteren genel şema .

Diğer -ome tabanlı teknolojilere benzer şekilde , transkriptom analizi, hipotezleri deneysel olarak doğrularken tarafsız bir yaklaşıma izin verir. Bu yaklaşım aynı zamanda sinyal yollarında yeni aracıların keşfedilmesine de olanak tanır. Diğer -omik tabanlı teknolojilerde olduğu gibi, transkriptome multiomik bir yaklaşım kapsamında analiz edilebilir . Metabolomikleri tamamlayıcıdır, ancak proteomiklerin aksine, bir transkript ve metabolit arasında doğrudan bir ilişki kurulamaz.

Transkriptomun alt kategorileri olarak görülebilecek birkaç -ome alanı vardır. Exome belirtilen bir hücre popülasyonunda bulunan yalnızca RNA moleküllerini içerir ve genellikle molekül kimlikleri ek olarak her bir RNA molekülünün bir miktarının veya konsantrasyonu içeren bu transcriptome farklıdır. Ek olarak, transkritpom, translasyon geçiren RNA'ların seti olan translatomdan da farklıdır .

Meiome terimi, fonksiyonel genomikte, mayoz transkriptomu veya mayoz süreci sırasında üretilen RNA transkriptleri setini tanımlamak için kullanılır . Mayoz bölünme, eşeyli üreyen ökaryotların önemli bir özelliğidir ve homolog kromozom , sinaps ve rekombinasyonun eşleşmesini içerir . Çoğu organizmada mayoz kısa bir süre içinde gerçekleştiğinden, mayotik hücrelerin ( mayositler ) izolasyonu (veya zenginleştirilmesi) zorluğundan dolayı mayotik transkript profili çıkarmak zordur . Transkriptome analizlerinde olduğu gibi, mayom, büyük ölçekli transkriptomik teknikler kullanılarak tüm genom seviyesinde incelenebilir. Mayom, memeli ve maya sistemlerinde iyi karakterize edilmiştir ve bitkilerde daha az kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir.

Thanatotranscriptome ifade edilmeye devam veya almaya başlamak tüm RNA transkriptleri oluşmaktadır yeniden ifade ölümünün ardından bir ceset 24-48 saat iç organlarında. Bazı genler, fetal gelişimden sonra inhibe edilenleri içerir . Thanatotransscriptome, programlanmış hücre ölümü ( apoptoz ) süreci ile ilgiliyse, apoptotik thanatotranscriptome olarak adlandırılabilir. Thanatotranskriptomun analizleri adli tıpta kullanılmaktadır .

eQTL eşlemesi, genomikleri transkriptomiklerle tamamlamak için kullanılabilir; DNA düzeyinde genetik varyantlar ve RNA düzeyinde gen ekspresyonu ölçümleri.

proteom ile ilişkisi

Transkriptom, proteomun bir alt kümesi , yani bir genom tarafından ifade edilen tüm protein kümesi olarak görülebilir .

Bununla birlikte, göreceli mRNA ekspresyon seviyelerinin analizi, mRNA ekspresyonundaki nispeten küçük değişikliklerin, hücrede bulunan karşılık gelen proteinin toplam miktarında büyük değişiklikler üretebilmesi gerçeğiyle karmaşıklaşabilir. Gen seti zenginleştirme analizi olarak bilinen bir analiz yöntemi, farklı hücre popülasyonlarında yukarı veya aşağı regüle edilen bireysel genler yerine ortak düzenlenmiş gen ağlarını tanımlar.

Mikrodizi çalışmaları, hücredeki farklı mRNA'ların nispi miktarlarını ortaya çıkarabilse de, mRNA seviyeleri, kodladıkları proteinlerin ekspresyon seviyesi ile doğru orantılı değildir . Bir şablon olarak belirli bir mRNA molekülü kullanılarak sentezlenen protein moleküllerinin sayısı, büyük ölçüde mRNA dizisinin translasyon-başlatma özelliklerine bağlıdır; özellikle, translasyon başlatma dizisinin yeteneği, protein translasyonu için ribozomların alınmasında anahtar bir belirleyicidir .

transkriptom veritabanları

  • Topluluk: [2]
  • OmicTools: [3]
  • Transkriptom Tarayıcısı: [4]
  • ArrayExpress: [5]

Ayrıca bakınız

Notlar

Referanslar

daha fazla okuma