DNA mikrodizisi - DNA microarray

Genotipleme için bir mikrodizi nasıl kullanılır? Video, mikrodiziler kullanarak bir insan tükürük örneğinden genotip çıkarma işlemini gösterir. Genotipleme, DNA mikrodizilerinin önemli bir kullanımıdır, ancak bazı modifikasyonlarla, gen ekspresyonunun ölçümü ve epigenetik belirteçler gibi başka amaçlar için de kullanılabilirler.

Bir DNA mikrodizisi (yaygın olarak DNA çipi veya biyoçip olarak da bilinir ), katı bir yüzeye tutturulmuş mikroskobik DNA lekeleri topluluğudur. Bilim adamları , aynı anda çok sayıda genin ekspresyon seviyelerini ölçmek veya bir genomun birden fazla bölgesini genotiplemek için DNA mikrodizilerini kullanır . Her bir DNA nokta içeren pikomol (10 -12 mol olarak bilinen belirli bir DNA dizisinin), prob (veya muhabir veya oligo ). Bunlar, yüksek katı koşullar altında bir cDNA veya cRNA'yı (anti-sens RNA olarak da adlandırılır) ( hedef olarak da adlandırılır) hibridize etmek için kullanılan bir genin veya başka bir DNA öğesinin kısa bir bölümü olabilir . Prob-hedef hibridizasyonu genellikle hedefteki nükleik asit dizilerinin nispi bolluğunu belirlemek için florofor -, gümüş- veya kemilüminesans - etiketli hedeflerin tespiti ile saptanır ve nicelenir. Orijinal nükleik asit dizileri, yaklaşık 9 cm x 12 cm makro dizilerdi ve ilk bilgisayarlı görüntü tabanlı analiz 1981'de yayınlandı. Patrick O. Brown tarafından icat edildi . Uygulamasının bir örneği, kardiyovasküler hastalıklar, kanser, patojenler ve GWAS analizindeki polimorfizmler için SNP dizileridir. Ayrıca yapısal varyasyonların tanımlanması ve gen ekspresyonunun ölçümü için.

Prensip

Hedefin proba hibridizasyonu

Mikrodizilerin arkasındaki temel ilke, tamamlayıcı nükleotit baz çiftleri arasında hidrojen bağları oluşturarak birbirleriyle spesifik olarak eşleşmek üzere tamamlayıcı nükleik asit dizilerinin özelliği olan iki DNA dizisi arasındaki hibridizasyondur . Bir nükleotid dizisindeki yüksek sayıda tamamlayıcı baz çifti , iki iplik arasında daha sıkı kovalent olmayan bağ anlamına gelir . Spesifik olmayan bağlanma dizileri yıkandıktan sonra, yalnızca güçlü bir şekilde eşleştirilmiş iplikler hibritlenmiş olarak kalacaktır. Bir prob dizisine bağlanan floresan olarak etiketlenmiş hedef diziler, hibridizasyon koşullarına (sıcaklık gibi) ve hibridizasyondan sonra yıkamaya bağlı bir sinyal üretir. Bir noktadan (özellik) gelen sinyalin toplam gücü, o noktada bulunan problara bağlanan hedef numune miktarına bağlıdır. Mikrodiziler, bir özelliğin yoğunluğunun aynı özelliğin farklı bir koşuldaki yoğunluğuyla karşılaştırıldığı ve özelliğin kimliğinin konumuyla bilindiği göreceli nicelemeyi kullanır.

Bir mikrodizi deneyinde gerekli adımlar

Kullanımları ve türleri

İki Affymetrix yongası. Boyut karşılaştırması için sol altta bir eşleşme gösterilir.

Pek çok dizi türü vardır ve en geniş ayrım, bunların bir yüzey üzerinde mi yoksa kodlanmış boncuklar üzerinde mi uzamsal olarak düzenlendiğidir:

  • Geleneksel katı faz dizisi, her biri cam , plastik veya silikon biyoçip (genel olarak genom çipi , DNA olarak bilinir) gibi katı bir yüzeye bağlı binlerce özdeş ve spesifik prob içeren, özellikler adı verilen düzenli mikroskobik "noktalar" topluluğudur. çip veya gen dizisi ). Bu özelliklerin binlercesi, tek bir DNA mikrodizisi üzerinde bilinen yerlere yerleştirilebilir.
  • Alternatif boncuk dizisi, her biri belirli bir proba ve hedef dizide kullanılan floresan boyalara müdahale etmeyen iki veya daha fazla boya oranına sahip mikroskobik polistiren boncuklar topluluğudur.

DNA mikrodizileri, DNA'yı ( karşılaştırmalı genomik hibridizasyonda olduğu gibi ) veya proteinlere çevrilebilen veya çevrilemeyen RNA'yı (çoğunlukla ters transkripsiyondan sonra cDNA olarak) saptamak için kullanılabilir . cDNA yoluyla gen ekspresyonunu ölçme işlemine ekspresyon analizi veya ekspresyon profili oluşturma denir .

Uygulamalar şunları içerir:

Uygulama veya teknoloji özet
Gen ifadesi profili oluşturma Bir mRNA veya gen ekspresyonu profilleme deneyinde, belirli tedavilerin, hastalıkların ve gelişim aşamalarının gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini incelemek için binlerce genin ekspresyon seviyeleri aynı anda izlenir . Örneğin, mikrodizi tabanlı gen ekspresyon profili, enfekte olmuş hücre veya dokulardaki gen ekspresyonu ile enfekte olmayan hücre veya dokuları karşılaştırarak ekspresyonu patojenlere veya diğer organizmalara yanıt olarak değişen genleri tanımlamak için kullanılabilir .
karşılaştırmalı genomik hibridizasyon Orijinal olarak Patrick Brown , Jonathan Pollack, Ash Alizadeh ve Stanford'daki meslektaşları tarafından tarif edildiği gibi, farklı hücrelerde veya yakından ilişkili organizmalarda genom içeriğinin değerlendirilmesi .
gen kimliği Gıda ve yemdeki organizmaların kimliklerini ( GDO [1] gibi ), hücre kültüründeki mikoplazmaları veya hastalık tespiti için patojenleri kontrol etmek için küçük mikrodiziler , çoğunlukla PCR ve mikrodizi teknolojisini birleştirir .
Çip üzerinde kromatin immünopresipitasyon Belirli bir proteine ​​bağlanan DNA dizileri, o proteinin ( ChIP ) immüno-çökeltilmesiyle izole edilebilir , bu fragmanlar daha sonra bir mikrodiziye (bir döşeme dizisi gibi) hibridize edilebilir ve genom boyunca protein bağlama yeri işgalinin belirlenmesine olanak tanır. Örnek proteini immünoçökeltme histon modifikasyonları (vardır H3K27me3 , H3K4me2, H3K9me3, vs.), Polycomb grup proteini (: Suz12, PRC1: YY1 PRC2) ve trithorax grup proteini (ash1) çalışma epigenetik manzara veya RNA polimeraz II araştırmaya transkripsiyon manzara .
baraj kimliği Analog olarak ChIP , ilgi konusu bir protein ile bağlı genomik bölge izole edilir ve bağlama sahası doluluk belirlemek için bir mikro sonda için kullanılabilir. ChIP'den farklı olarak, DamID antikorlara ihtiyaç duymaz, ancak bakteriyel DNA adenin metiltransferaz ile kaynaştırılmış ilgili proteinin çok küçük miktarlarını eksprese ederek bu bölgeleri seçici olarak büyütmek için proteinin bağlanma bölgelerinin yakınında adenin metilasyonunu kullanır .
SNP algılama Popülasyonlar içindeki veya arasındaki aleller arasında tek nükleotid polimorfizminin belirlenmesi . Mikrodizilerin çeşitli uygulamaları, genotipleme , adli analiz, hastalığa yatkınlığın ölçülmesi , ilaç adaylarının belirlenmesi, bireylerde germ hattı mutasyonlarının veya kanserlerdeki somatik mutasyonların değerlendirilmesi , heterozigotluk kaybının değerlendirilmesi veya genetik bağlantı analizi dahil olmak üzere SNP saptamasından yararlanır .
Alternatif ekleme algılama Bir ekson bağlantı dizisi tasarımı, bir gen için öngörülen ekzonların beklenen veya potansiyel ekleme bölgelerine özgü probları kullanır . Tipik bir gen ekspresyon dizisine (gen başına 1-3 prob ile) ve bir genomik döşeme dizisine (gen başına yüzlerce veya binlerce prob ile) orta yoğunlukta veya kapsama alanındadır. Bir genin alternatif ek formlarının ekspresyonunu tahlil etmek için kullanılır. Ekson dizileri , bilinen veya tahmin edilen genler için her bir eksonu tespit etmek üzere tasarlanmış probları kullanan farklı bir tasarıma sahiptir ve farklı birleştirme izoformlarını tespit etmek için kullanılabilir.
Füzyon genleri mikrodizisi Bir Füzyon gen mikrodizisi, örneğin kanser örneklerinden alınan füzyon transkriptlerini saptayabilir . Bunun arkasındaki ilke, alternatif ekleme mikrodizileri üzerine inşa etmektir . Oligo tasarım stratejisi, bireysel füzyon ortaklarının ekzon ölçümleriyle kimerik transkript bağlantılarının birleştirilmiş ölçümlerini sağlar.
döşeme dizisi Genom döşeme dizileri, bazen bütün bir insan kromozomu kadar büyük, ilgilenilen bir genomik bölgeyi yoğun bir şekilde temsil etmek üzere tasarlanmış örtüşen problardan oluşur. Amaç, daha önce bilinmeyen veya tahmin edilmemiş olabilecek transkriptlerin veya alternatif olarak eklenmiş formların ekspresyonunu ampirik olarak tespit etmektir .
Çift sarmallı B-DNA mikrodizileri Sağ elle kullanılan çift sarmallı B-DNA mikrodizileri, hareketsizleştirilmiş, bozulmamış, çift sarmallı DNA'nın belirli bölgelerini bağlamak için kullanılabilen yeni ilaçları ve biyolojikleri karakterize etmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, gen ekspresyonunu inhibe etmek için kullanılabilir. Ayrıca farklı çevresel koşullar altında yapılarının karakterizasyonuna izin verirler.
Çift sarmallı Z-DNA mikrodizileri Solak çift sarmallı Z-DNA mikrodizileri, sağ elini kullanan B-DNA genlerinin daha uzun uzantıları içinde bulunan alternatif Z-DNA yapısının kısa dizilerini tanımlamak için kullanılabilir (örneğin, transkripsiyonel güçlendirme, rekombinasyon, RNA düzenleme). Mikrodiziler ayrıca farklı çevresel koşullar altında yapılarının karakterizasyonuna izin verir.
Çok iplikli DNA mikrodizileri (tripleks-DNA mikrodizileri ve dörtlü-DNA mikrodizileri) Çok zincirli DNA ve RNA mikrodizileri, bu çok zincirli nükleik asit dizilerine bağlanan yeni ilaçları tanımlamak için kullanılabilir. Bu yaklaşım, gen ekspresyonunu inhibe etme yeteneğine sahip yeni ilaçları ve biyolojikleri keşfetmek için kullanılabilir. Bu mikrodiziler, farklı çevresel koşullar altında yapılarının karakterizasyonuna da izin verir.

Belirli ürünlere göre uyarlanmış özel diziler , moleküler ıslah uygulamalarında giderek daha popüler hale geliyor . Gelecekte , yetiştirme operasyonlarında denenen gereksiz fidan sayısını azaltmak için fideleri erken aşamalarda taramak için kullanılabilirler .

Yapılışı

Mikrodiziler, incelenen prob sayısına, maliyetlere, özelleştirme gereksinimlerine ve sorulan bilimsel sorunun türüne bağlı olarak farklı şekillerde üretilebilir. Ticari satıcılardan gelen diziler, en az 10 proba veya 5 milyona kadar veya daha fazla mikrometre ölçekli proba sahip olabilir.

Spotted ve in situ sentezlenmiş diziler

Bir DNA mikro bir tarafından basılan robot de Delaware Üniversitesi

Mikroarray'ler, cam slaytlar üzerine ince uçlu iğnelerle baskı da dahil olmak üzere çeşitli teknolojiler kullanılarak imal edilebilir fotolitografiden dinamik Micromirror cihazları, mürekkep püskürtmeli baskı ya da kullanan fotolitografya, önceden hazırlanmış maskeler kullanarak elektrokimya mikroelektrot diziler üzerinde.

Gelen benekli mikrodizileri , problar oligonükleotitler , cDNA ya da küçük fragmanları , PCR ürünlerine olduğu tekabül mRNA . Problar , dizi yüzeyinde biriktirmeden önce sentezlenir ve daha sonra cam üzerine "lekelenir". Yaygın bir yaklaşım, DNA probları içeren kuyulara daldırılan robotik bir kol tarafından kontrol edilen ve ardından her bir probu dizi yüzeyinde belirlenmiş konumlara bırakan bir dizi ince iğne veya iğne kullanır. Ortaya çıkan prob "ızgarası", hazırlanan probların nükleik asit profillerini temsil eder ve deneysel veya klinik örneklerden türetilen tamamlayıcı cDNA veya cRNA "hedeflerini" almaya hazırdır. Bu teknik, dünyanın dört bir yanındaki araştırmacı bilim adamları tarafından kendi laboratuvarlarından "kurum içi" basılı mikrodiziler üretmek için kullanılmaktadır. Bu diziler, her deney için kolayca özelleştirilebilir, çünkü araştırmacılar diziler üzerindeki probları ve yazdırma konumlarını seçebilir, probları kendi laboratuvarlarında (veya ortak çalışma tesislerinde) sentezleyebilir ve dizileri tespit edebilir. Daha sonra hibridizasyon için kendi etiketli örneklerini oluşturabilir, örnekleri diziye melezleştirebilir ve son olarak dizileri kendi ekipmanlarıyla tarayabilirler. Bu, her çalışma için özelleştirilebilen nispeten düşük maliyetli bir mikrodizi sağlar ve araştırmacının ilgisini çekmeyen çok sayıda geni temsil edebilen genellikle daha pahalı ticari dizileri satın alma maliyetlerinden kaçınır. Şirket içi lekeli mikrodizilerin, ticari oligonükleotid dizileri ile karşılaştırıldığında, muhtemelen küçük parti boyutları ve oligo dizilerinin endüstriyel imalatçıları ile karşılaştırıldığında azaltılmış baskı verimleri nedeniyle aynı düzeyde hassasiyet sağlayamayacağını gösteren yayınlar mevcuttur.

Olarak oligonükleotid array , problar bilinen ya da kestirilmiş dizisinin kısımlarını eşleşecek şekilde tasarlanmış kısa sekanslarıdır açık okuma çerçevelerinin . Oligonükleotid probları sıklıkla "noktalı" mikrodizilerde kullanılmasına rağmen, "oligonükleotid dizisi" terimi çoğunlukla spesifik bir üretim tekniğine atıfta bulunur. Oligonükleotit dizileri, tek bir geni veya gen ek varyantları ailesini temsil etmek üzere tasarlanan kısa oligonükleotit dizilerinin , bozulmamış dizileri biriktirmek yerine bu diziyi doğrudan dizi yüzeyi üzerine sentezleyerek yazdırarak üretilir . Arzu edilen amaca bağlı olarak diziler daha uzun ( Agilent tasarımı gibi 60-mer problar ) veya daha kısa ( Affymetrix tarafından üretilen 25-mer problar ) olabilir; daha uzun problar bireysel hedef genlere daha spesifiktir, daha kısa problar dizi boyunca daha yüksek yoğunlukta tespit edilebilir ve üretimi daha ucuzdur. Oligonükleotid dizilerini üretmek için kullanılan bir teknik , bir silika substrat üzerinde fotolitografik sentezi (Affymetrix) içerir; burada ışığa ve ışığa duyarlı maskeleme ajanları, tüm dizi boyunca bir seferde bir nükleotid dizisi "oluşturmak" için kullanılır. Her uygulanabilir prob, diziyi tek bir nükleotit çözeltisinde yıkamadan önce seçici olarak "maskelenir", ardından bir maskeleme reaksiyonu gerçekleşir ve sonraki prob seti, farklı bir nükleotit maruziyetine hazırlık olarak maskelenir. Birçok tekrardan sonra, her sondanın dizileri tam olarak oluşturulur. Daha yakın zamanlarda, NimbleGen Systems'ın Maskesiz Dizi Sentezi, esnekliği çok sayıda probla birleştirdi.

İki kanallı ve tek kanallı algılama

Tipik çift renkli mikrodizi deneyinin diyagramı

İki renkli mikrodiziler veya iki kanallı mikrodiziler tipik olarak karşılaştırılacak (örneğin hastalıklı dokuya karşı sağlıklı doku) ve iki farklı floroforla etiketlenen iki numuneden hazırlanan cDNA ile hibridize edilir . cDNA etiketlemesi için yaygın olarak kullanılan floresan boyalar , 570 nm'lik bir floresan emisyon dalga boyuna (ışık tayfının yeşil kısmına karşılık gelir) sahip olan Cy 3'ü ve 670 nm'lik bir floresan emisyon dalga boyuna sahip olan Cy 5'i (ışık tayfının kırmızı kısmına karşılık gelen) içerir. ışık spektrumu). İki Cy-etiketli cDNA numunesi karıştırılır ve daha sonra tanımlanmış bir dalga boyunda bir lazer ışını ile uyarıldıktan sonra iki flüoroforun flüoresansını görselleştirmek için bir mikrodizi tarayıcıda taranan tek bir mikrodiziye hibridize edilir . Her bir floroforun nispi yoğunlukları daha sonra yukarı regüle edilmiş ve aşağı regüle edilmiş genleri tanımlamak için orana dayalı analizde kullanılabilir.

Oligonükleotid mikrodizileri genellikle RNA spike-in'leri ile hibritleşmek üzere tasarlanmış kontrol probları taşır . Spike-in'ler ve kontrol probları arasındaki hibridizasyon derecesi , hedef problar için hibridizasyon ölçümlerini normalleştirmek için kullanılır . Nadir durumlarda iki renkli dizide mutlak gen ifadesinin seviyeleri belirlenebilse de, bir numune içindeki farklı noktalar arasındaki ve numuneler arasındaki ifadedeki nispi farklılıklar , iki renkli sistem için tercih edilen veri analizi yöntemidir . Bu tür mikrodiziler için sağlayıcı örnekleri arasında Çift Modlu platformlarıyla Agilent , kolorimetrik Silverquant etiketleme için DualChip platformlarıyla Eppendorf ve Arrayit ile TeleChem International yer alır .

İçinde tek kanal mikrodiziler veya tek renkli mikrodizileri , diziler etiketli hedef hibridizasyon göreli seviyesini gösteren her bir prob ya da prob seti için yoğunluk verileri sağlar. Bununla birlikte, aynı deneyde işlendiklerinde diğer numuneler veya koşullarla karşılaştırıldığında, bir genin bolluk seviyelerini gerçekten göstermezler, daha ziyade göreceli bolluğu gösterirler. Her RNA molekülü, aynı mikrodizi için genler arasında bilgi vermeyen karşılaştırmalar yapan deneyin amplifikasyon, etiketleme ve hibridizasyon aşamaları sırasında protokol ve partiye özgü önyargı ile karşılaşır. Aynı gen için iki koşulun karşılaştırılması, iki ayrı tek boya hibridizasyonu gerektirir. Birkaç popüler tek kanallı sistem, Affymetrix "Gene Chip", Illumina "Bead Chip", Agilent tek kanallı diziler, Applied Microarrays "CodeLink" dizileri ve Eppendorf "DualChip & Silverquant"tır. Tek boya sisteminin bir gücü, anormal bir numunenin diğer numunelerden elde edilen ham verileri etkileyememesi gerçeğinde yatmaktadır, çünkü her bir dizi çipi yalnızca bir numuneye maruz kalmaktadır (tek bir düşük -kaliteli örnek, diğer örnek yüksek kalitede olsa bile genel veri kesinliğini büyük ölçüde etkileyebilir). Diğer bir fayda, toplu etkiler hesaba katıldığı sürece verilerin farklı deneylerdeki dizilerle karşılaştırıldığında daha kolay olmasıdır.

Bazı durumlarda tek kanallı mikrodizi tek seçenek olabilir. Örneklerin karşılaştırılması gerektiğini varsayalım : o zaman iki kanal dizisini kullanarak gereken deney sayısı, bir örnek referans olarak kullanılmadığı sürece hızla olanaksız hale gelir.

örnek sayısı tek kanallı mikrodizi iki kanallı mikrodizi

iki kanallı mikrodizi (referans ile)

1 1 1 1
2 2 1 1
3 3 3 2
4 4 6 3

Tipik bir protokol

Mikrodizilerin uygulama düzeylerine örnekler. Organizmalar içinde, genler kopyalanır ve olgun mRNA transkriptlerini (kırmızı) üretmek için birleştirilir. mRNA organizmadan ekstrakte edilir ve mRNA'yı stabil ds-cDNA'ya (mavi) kopyalamak için ters transkriptaz kullanılır. Mikrodizilerde, ds-cDNA parçalanır ve floresan olarak etiketlenir (turuncu). Etiketli fragmanlar, sıralı bir tamamlayıcı oligonükleotid dizisine bağlanır ve dizi boyunca floresan yoğunluğunun ölçümü, önceden belirlenmiş bir dizi dizisinin bolluğunu gösterir. Bu diziler tipik olarak organizmanın genomu içindeki ilgili genler hakkında rapor vermek üzere özel olarak seçilir.

Bu, RNA veya diğer alternatif deneyler için modifikasyonları listelerken, DNA mikrodizi deneylerini daha iyi açıklamak için belirli bir duruma ilişkin ayrıntıları içeren bir DNA mikrodizi deneyinin bir örneğidir .

  1. Karşılaştırılacak iki numune (ikili karşılaştırma) büyütülür/alınır. Bu örnekte, işlenmiş numune ( vaka ) ve işlenmemiş numune ( kontrol ).
  2. Nükleik asit ilgi saflaştırılır Bu olabilir RNA için ekspresyon profili , DNA, için karşılaştırmalı melezleme ya da DNA / RNA belirli bağlanan protein olan immünopresipitasyon ( kart üzerinde çip çip için) epigenetik veya düzenleme çalışmaları. Bu örnekte toplam RNA, Guanidinium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu (örneğin Trizol ) ile izole edilir (hem nükleer hem de sitoplazmik ), bu da çoğu RNA'yı izole eder (kolon yöntemlerinde 200 nükleotidlik bir kesim vardır) ve doğru yapılırsa daha iyi bir saflığa sahiptir.
  3. Saflaştırılmış RNA, kalite ( kılcal elektroforez ile ) ve miktar (örneğin, bir NanoDrop veya NanoPhotometer spektrometresi kullanılarak) için analiz edilir . Malzeme kabul edilebilir kalitedeyse ve yeterli miktarda mevcutsa (örneğin, gerekli miktar mikrodizi platformuna göre değişse de >1 μg ), deney devam edebilir.
  4. Etiketli ürün, ters transkripsiyon yoluyla üretilir ve ardından isteğe bağlı bir PCR amplifikasyonu yapılır. RNA, polyT primerleri (sadece mRNA'yı yükselten ) veya rastgele primerler (çoğu rRNA olan tüm RNA'yı çoğaltan) ile ters kopyalanır . miRNA mikrodizileri, bir oligonükleotidi saflaştırılmış küçük RNA'ya (bir fraksiyonlayıcı ile izole edilmiş) bağlar, bu daha sonra ters kopyalanır ve çoğaltılır.
    • Etiket, ters transkripsiyon adımı sırasında veya gerçekleştirilirse amplifikasyonun ardından eklenir. Duyu etiketleme mikroarray bağlıdır; örneğin, etiket RT karışımı ile eklenirse, cDNA antisenstir ve mikrodizi probu, negatif kontroller dışında anlamlıdır.
    • Etiket tipik olarak floresandır ; sadece bir makine radyo etiketlerini kullanır .
    • Etiketleme doğrudan (kullanılmaz) veya dolaylı (bir bağlantı aşaması gerektirir) olabilir. İki kanallı diziler için, birleştirme aşaması, aminoallil üridin trifosfat (aminoallil-UTP veya aaUTP) ve NHS amino-reaktif boyalar ( siyanin boyaları gibi ) kullanılarak hibridizasyondan önce gerçekleşir ; tek kanallı diziler için, birleştirme aşaması, biotin ve etiketli streptavidin kullanılarak hibridizasyondan sonra gerçekleşir . Modifiye edilmiş nükleotitler (genellikle 1 aaUTP: 4 TTP ( timidin trifosfat ) oranında) normal nükleotitlere düşük oranda enzimatik olarak eklenir ve tipik olarak her 60 bazda 1 ile sonuçlanır. AaDNA sonra arıtılır kolonu (olarak, bir fosfat tampon çözeltisi kullanılarak Tris amin grupları içerir). Aminoallil grubu, reaktif bir boya ile reaksiyona giren, nükleobaza bağlı uzun bir bağlayıcı üzerindeki bir amin grubudur.
      • İki kanallı deneylerde boya artefaktlarını kontrol etmek için boya çevirme olarak bilinen bir kopya formu gerçekleştirilebilir ; bir boya çevirme için, etiketlerin değiştirildiği ikinci bir slayt kullanılır (ilk slaytta Cy3 ile etiketlenen numune Cy5 ile etiketlenir ve bunun tersi de geçerlidir). Bu örnekte aminoallil -UTP, ters kopyalanmış karışımda mevcuttur.
  5. İşaretlenmiş örnekler daha sonra özel bir karıştırılır hibridizasyon oluşur hangi çözeltisi SDS , SSC , dekstran sülfat , (örneğin, bir bloke edici madde, yatak-1 DNA , somon spermi DNA'sı, dana timüs DNA'sı, poliA , ya da polı-T) Denhardt çözeltisi , veya formamin .
  6. Karışım denatüre edilir ve mikrodizinin iğne deliklerine eklenir. Delikler kapatılır ve mikrodizi, ya mikrodizinin döndürülerek karıştırıldığı bir hyb fırınında ya da mikrodizinin iğne deliklerinde değişen basınçla karıştırıldığı bir karıştırıcıda hibritlenir.
  7. Bir gecelik hibridizasyondan sonra, tüm spesifik olmayan bağlanma yıkanır (SDS ve SSC).
  8. Mikrodizi, boyayı uyarmak için lazer kullanan ve bir dedektörle emisyon seviyelerini ölçen bir makine tarafından kurutulur ve taranır.
  9. Görüntü bir şablonla ızgaralanır ve her bir özelliğin (birkaç pikselden oluşan) yoğunluğu ölçülür.
  10. Ham veriler normalleştirilir; en basit normalleştirme yöntemi, iki kanalın özelliklerinin toplam yoğunluklarının eşit olması için arka plan yoğunluğunu ve ölçeği çıkarmak veya tüm yoğunluklar için t-değerini hesaplamak için bir referans genin yoğunluğunu kullanmaktır. Daha karmaşık yöntemler, Affymetrix çipleri (tek kanallı, silikon çip, yerinde sentezlenmiş kısa oligonükleotitler) için z-oranını , loess ve lowess regresyonunu ve RMA'yı (sağlam çoklu çip analizi ) içerir.

Mikrodiziler ve biyoinformatik

Mikrodizi deneylerinden elde edilen gen ifadesi değerleri , veri analizinin sonucunu görselleştirmek için ısı haritaları olarak temsil edilebilir .

Ucuz mikrodizi deneylerinin ortaya çıkışı, birkaç özel biyoinformatik zorluk yarattı: deneysel tasarımda çoklu replikasyon seviyeleri ( Deneysel tasarım ); platformların ve bağımsız grupların sayısı ve veri formatı ( Standardizasyon ); verilerin istatistiksel olarak işlenmesi ( Veri analizi ); her bir sondayı ölçtüğü mRNA transkriptiyle eşleştirme ( Annotation ); büyük miktarda veri ve onu paylaşma yeteneği ( Veri ambarı ).

Deneysel tasarım

Gen ifadesinin biyolojik karmaşıklığı nedeniyle , verilerden istatistiksel ve biyolojik olarak geçerli sonuçlar çıkarılacaksa , ifade profili oluşturma makalesinde tartışılan deneysel tasarımla ilgili düşünceler kritik öneme sahiptir.

Bir mikrodizi deneyi tasarlarken göz önünde bulundurulması gereken üç ana unsur vardır. İlk olarak, deneyden sonuç çıkarmak için biyolojik örneklerin kopyalanması esastır. İkincisi, teknik kopyalar (her deney ünitesinden elde edilen iki RNA örneği), kesinliğin sağlanmasına yardımcı olur ve tedavi grupları içinde test farklılıklarına izin verir. Biyolojik kopyalar, bağımsız RNA ekstraksiyonlarını içerir ve teknik kopyalar , aynı ekstraksiyonun iki alikotu olabilir . Üçüncüsü, her bir hibridizasyonda bir teknik kesinlik ölçüsü sağlamak için her cDNA klonunun veya oligonükleotidin noktaları, mikrodizi slaydı üzerinde kopyalar (en azından kopyalar) olarak bulunur. Deneydeki bağımsız birimlerin belirlenmesine yardımcı olmak ve istatistiksel anlamlılığa ilişkin abartılı tahminlerden kaçınmak için numune hazırlama ve işleme hakkındaki bilgilerin tartışılması çok önemlidir .

Standardizasyon

Platform imalatında, tahlil protokollerinde ve analiz yöntemlerinde standardizasyon eksikliği nedeniyle mikrodizi verilerinin değişimi zordur. Bu , biyoinformatikte birlikte çalışabilirlik sorunu sunar . Çeşitli yerel açık kaynak projeleri, tescilli olmayan çiplerle üretilen verilerin değişimini ve analizini kolaylaştırmaya çalışıyor:

Örneğin, " Microarray Experiment Hakkında Asgari Bilgi" ( MIAME ) kontrol listesi, olması gereken ayrıntı düzeyini tanımlamaya yardımcı olur ve mikrodizi sonuçlarını içeren makalelerin sunulması için bir gereklilik olarak birçok dergi tarafından benimsenmektedir . Ancak MIAME bilgi formatını tanımlamamaktadır, bu nedenle birçok format MIAME gereksinimlerini destekleyebilirken, 2007 itibariyle hiçbir format tam anlamsal uygunluğun doğrulanmasına izin vermemektedir. "MicroArray Kalite Kontrol (MAQC) Projesi", ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından, sonunda MicroArray verilerinin ilaç keşfi, klinik uygulama ve düzenleyici karar vermede kullanılmasına izin verecek standartlar ve kalite kontrol ölçümleri geliştirmek için yürütülmektedir. . MGED Toplum gen ifadesi deney sonuçlarının ve ilgili ek açıklamaların gösterimi için standartlar geliştirmiştir.

Veri analizi

Ulusal Toksikolojik Araştırma Merkezi bilim adamı mikrodizi verilerini inceliyor

Mikrodizi veri kümeleri genellikle çok büyüktür ve analitik kesinlik bir dizi değişkenden etkilenir. İstatistiksel zorluklar, arka plan gürültüsünün etkilerinin dikkate alınmasını ve verilerin uygun şekilde normalleştirilmesini içerir. Normalleştirme yöntemleri, belirli platformlara uygun olabilir ve ticari platformlar söz konusu olduğunda, analiz tescilli olabilir. İstatistiksel analizi etkileyen algoritmalar şunları içerir:

  • Görüntü analizi: gridding, taranan görüntü (bölütleme algoritması) ve bir noktada tanınması, çıkarma veya düşük kaliteli ve düşük yoğunluklu özellikleri (denilen işaretlenmesi işaretleme ).
  • Veri işleme: (global veya yerel birikimine göre) arka plan çıkarma, spot şiddetleri ve yoğunluk oranları, verilerin görselleştirilmesi belirlenmesi (örn bakınız MA arsa ) ve oranları, küresel veya log-dönüşüm yerel yoğunluk oranlarının normalleşmesi ve segmentasyon içine adım algılama algoritmalarını kullanarak farklı kopya sayısı bölgeleri .
  • Sınıf keşif analizi: Bazen denetimsiz sınıflandırma veya bilgi keşfi olarak adlandırılan bu analitik yaklaşım, mikrodizilerin (nesneler, hastalar, fareler vb.) veya genlerin gruplar halinde kümelenip kümelenmediğini belirlemeye çalışır. Birlikte kümelenen doğal olarak var olan nesne gruplarını (mikrodiziler veya genler) belirlemek, daha önce var olmadığı bilinmeyen yeni grupların keşfedilmesini sağlayabilir. Bilgi keşfi analizi sırasında, dizilerin yeni kümelerini (sınıflarını) tanımlamak için DNA mikrodizi verileriyle çeşitli denetimsiz sınıflandırma teknikleri kullanılabilir. Bu tür bir yaklaşım hipoteze dayalı değildir, daha çok verilerde "optimal" sayıda küme bulmak için yinelemeli örüntü tanıma veya istatistiksel öğrenme yöntemlerine dayanır. Denetimsiz analiz yöntemlerinin örnekleri arasında kendi kendini organize eden haritalar, sinir gazı, k-ortalama küme analizleri, hiyerarşik küme analizi, Genomik Sinyal İşleme tabanlı kümeleme ve model tabanlı küme analizi yer alır. Bu yöntemlerden bazıları için kullanıcının ayrıca nesne çiftleri arasında bir mesafe ölçüsü tanımlaması gerekir. Pearson korelasyon katsayısı genellikle kullanılmasına rağmen, literatürde birkaç başka ölçü önerilmiş ve değerlendirilmiştir. Sınıf keşif analizlerinde kullanılan girdi verileri, yaygın olarak, varyasyon katsayısının düşük değerlerine veya Shannon entropisinin yüksek değerlerine, vb. dayalı olarak yüksek bilgilendiriciliğe (düşük gürültü) sahip gen listelerine dayanır. En olası veya optimal sayının belirlenmesi. Denetimsiz bir analizden elde edilen kümelere küme geçerliliği denir. Küme geçerliliği için yaygın olarak kullanılan bazı metrikler, siluet indeksi, Davies-Bouldin indeksi, Dunn indeksi veya Hubert'in istatistiğidir.
  • Sınıf tahmin analizi: Denetimli sınıflandırma adı verilen bu yaklaşım, test nesnelerinin en olası sınıf üyeliğini tahmin etmek için gelecekteki bilinmeyen test nesnelerinin girilebileceği bir tahmine dayalı model geliştirmek için temel oluşturur. Sınıf tahmini için denetimli analiz, doğrusal regresyon, k-en yakın komşu, öğrenme vektör niceleme, karar ağacı analizi, rastgele ormanlar, saf Bayes, lojistik regresyon, çekirdek regresyon, yapay sinir ağları, destek vektör makineleri, uzmanların karışımı gibi tekniklerin kullanımını içerir . , ve denetimli nöral gaz. Ek olarak, genetik algoritmalar , kovaryans matrisi kendi kendine uyarlama, parçacık sürüsü optimizasyonu ve karınca kolonisi optimizasyonu gibi çeşitli metasezgisel yöntemler kullanılır . Sınıf tahmini için girdi verileri genellikle, klasik hipotez testleri (sonraki bölüm), Gini çeşitlilik indeksi veya bilgi kazancı (entropi) kullanılarak belirlenen, sınıfı öngören filtrelenmiş gen listelerine dayanır.
  • Hipoteze dayalı istatistiksel analiz: Gen ifadesindeki istatistiksel olarak anlamlı değişikliklerin tanımlanması, yaygın olarak , çoklu karşılaştırmaları veya küme analizini hesaba katan mikrodizi veri setlerine uyarlanmış t-testi , ANOVA , Bayes yöntemi Mann-Whitney test yöntemleri kullanılarak tanımlanır . Bu yöntemler, verilerde bulunan varyasyona ve deneysel tekrarların sayısına dayalı olarak istatistiksel gücü değerlendirir ve analizlerdeki Tip I ve Tip II hataları en aza indirmeye yardımcı olabilir .
  • Boyutsal küçültme: Analistler genellikle veri analizinden önce boyutların (genlerin) sayısını azaltır. Bu, temel bileşenler analizi (PCA) gibi doğrusal yaklaşımları veya çekirdek PCA, difüzyon haritaları, Laplacian öz haritaları, yerel doğrusal yerleştirme, yerel olarak koruma projeksiyonları ve Sammon'un haritalaması kullanılarak doğrusal olmayan manifold öğrenme (mesafe metrik öğrenme) içerebilir.
  • Ağa dayalı yöntemler: Gen ürünleri arasındaki ilişkisel veya nedensel etkileşimleri veya bağımlılıkları temsil eden, gen ağlarının altında yatan yapıyı hesaba katan istatistiksel yöntemler. Ağırlıklı gen birlikte ekspresyon ağ analizi , ortak ekspresyon modüllerini ve intramodüler hub genlerini tanımlamak için yaygın olarak kullanılır. Modüller, hücre tiplerine veya yollara karşılık gelebilir. Yüksek düzeyde bağlı modüller arası hub'lar, ilgili modüllerini en iyi şekilde temsil eder.

Mikrodizi verileri, anlamaya ve daha odaklı analize yardımcı olmak için verilerin boyutsallığını azaltmayı amaçlayan daha fazla işlem gerektirebilir. Diğer yöntemler, düşük sayıda biyolojik veya teknik kopyadan oluşan verilerin analizine izin verir ; örneğin, Yerel Havuzlanmış Hata (LPE) testi , yetersiz replikasyonu telafi etmek için benzer ekspresyon seviyelerine sahip genlerin standart sapmalarını bir araya toplar.

Dipnot

Bir sonda ile tespit etmesi beklenen mRNA arasındaki ilişki önemsiz değildir. Bazı mRNA'lar, dizideki başka bir mRNA'yı algılaması beklenen probları çapraz hibritleyebilir. Ek olarak, mRNA'lar diziye veya moleküle özgü olan amplifikasyon yanlılığı yaşayabilir. Üçüncüsü, belirli bir genin mRNA'sını saptamak için tasarlanan sondalar, o genle yanlış bir şekilde ilişkilendirilen genomik EST bilgisine dayanıyor olabilir .

Veri depolama

Mikrodizi verilerinin diğer benzer veri kümelerine göre daha kullanışlı olduğu görülmüştür. Veri kümeleriyle ilişkili çok büyük miktarda veri, özel biçimler ( MIAME gibi ) ve iyileştirme çabaları, verileri depolamak için özel veritabanları gerektirir. InterMine ve BioMart gibi bir dizi açık kaynaklı veri ambarı çözümü, çeşitli biyolojik veri kümelerini entegre etmek ve ayrıca analizi desteklemek amacıyla oluşturulmuştur.

Alternatif teknolojiler

Büyük ölçüde paralel dizilemedeki ilerlemeler, gen ifadesini karakterize etmek ve ölçmek için tam bir transkriptom av tüfeği yaklaşımı sağlayan RNA-Seq teknolojisinin geliştirilmesine yol açmıştır . Mikrodizinin kendisi tasarlanmadan önce mevcut olması için bir referans genom ve transkriptom gerektiren mikrodizilerin aksine, RNA-Seq, genomu henüz dizilenmemiş yeni model organizmalar için de kullanılabilir.

Sözlük

  • Bir dizi veya slayt , iki boyutlu bir ızgarada uzamsal olarak düzenlenmiş, sütunlar ve satırlar halinde düzenlenmiş bir özellikler topluluğudur .
  • Blok veya alt dizi : tipik olarak bir baskı turunda yapılan bir grup nokta; birkaç alt dizi/blok bir dizi oluşturur.
  • Vaka/kontrol : kontrol olarak seçilen bir koşulun (sağlıklı doku veya durum gibi) değiştirilmiş bir durumla (hastalıklı bir doku veya durum gibi) karşılaştırıldığı iki renkli dizi sistemine özellikle uygun bir deneysel tasarım paradigması.
  • Kanal :ayrı bir florofor için tarayıcıda kaydedilen floresan çıktısıve hatta ultraviyole olabilir.
  • Boya çevirme veya boya takası veya flor ters çevirme : deneylerde boya yanlılığını hesaba katmak için iki boya ile DNA hedeflerinin karşılıklı etiketlenmesi.
  • Tarayıcı : Bir lazerle floroforları seçici olarak uyararak ve bir filtre (optik) fotoçoğaltıcı sistemiyle floresansı ölçerek, bir mikrodizi slayt üzerindeki noktaların floresan yoğunluğunu algılamak ve ölçmek için kullanılan bir cihaz .
  • Nokta veya özellik : Bir dizi slaydı üzerinde, belirli DNA örneklerinin pikomollerini içeren küçük bir alan.
  • Diğer ilgili terimler için bakınız:

Ayrıca bakınız

Referanslar

Dış bağlantılar