Döşeme dizisi - Tiling array
Döşeme dizileri , mikrodizi yongalarının bir alt türüdür . Geleneksel mikrodiziler gibi, etiketli DNA veya RNA hedef moleküllerini katı bir yüzeye sabitlenmiş problara hibridize ederek işlev görürler .
Döşeme dizileri, probların doğası gereği geleneksel mikrodizilerden farklıdır. Genom boyunca dağılabilen bilinen veya tahmin edilen genlerin dizilerini araştırmak yerine , döşeme dizileri, bitişik bir bölgede var olduğu bilinen dizileri yoğun bir şekilde araştırır. Bu, sıralanmış ancak yerel işlevleri büyük ölçüde bilinmeyen bölgeleri karakterize etmek için kullanışlıdır. Döşeme dizileri , DNA/ protein etkileşimi ( ChIP-chip , DamID ), DNA metilasyonu (MeDIP-chip) ve DNase (DNase Chip) ve dizi CGH'ye duyarlılık bölgelerinin keşfedilmesinin yanı sıra transkriptom haritalamasına yardımcı olur . Önceden tanımlanmamış genlerin ve düzenleyici dizilerin saptanmasına ek olarak, transkripsiyon ürünlerinin daha iyi nicelenmesi mümkündür. Özel problar, dizi başına 10.000 ila 6.000.000'dan fazla farklı özelliğe sahip, özellik adı verilen bir dizi birimi içinde milyonlarca kopyada (geleneksel dizilerde yalnızca birkaç tanesinin aksine) bulunur. Değişken eşleme çözünürlükleri, problar arasındaki dizi örtüşme miktarını veya prob dizileri arasındaki bilinen baz çiftlerinin miktarını ve ayrıca prob uzunluğunu ayarlayarak elde edilebilir . Arabidopsis gibi daha küçük genomlar için bütün genomlar incelenebilir. Döşeme dizileri, genom çapında ilişkilendirme çalışmalarında yararlı bir araçtır .
Sentez ve üreticiler
Döşeme dizilerini sentezlemenin iki ana yolu, fotolitografik üretim ve mekanik lekeleme veya baskıdır.
İlk yöntem , yaklaşık 25bp'lik probların çipin yüzeyi üzerine inşa edildiği yerinde sentezi içerir . Bu diziler, her biri bir probun milyonlarca kopyasını içeren 6 milyona kadar ayrık özelliği tutabilir.
Döşeme dizisi çiplerini sentezlemenin diğer bir yolu, çip üzerine probların mekanik olarak yazdırılmasıdır. Bu, önceden sentezlenmiş probları yüzeye yerleştiren pimli otomatik makineler kullanılarak yapılır. Pimlerin boyut kısıtlaması nedeniyle, bu yongalar yaklaşık 400.000 özelliği tutabilir. Üç döşeme dizisi üreticisi Affymetrix , NimbleGen ve Agilent'tir . Ürünleri prob uzunluğu ve aralığı bakımından farklılık gösterir. ArrayExplorer.com, döşeme dizilerini karşılaştırmak için ücretsiz bir web sunucusudur.
Uygulamalar ve türleri
çip-çip
ChIP-chip, döşeme dizilerinin en popüler kullanımlarından biridir. Kromatin immünopresipitasyon , proteinlerin bağlanma bölgelerinin tanımlanmasına izin verir . Bunun genom çapında bir varyasyonu, çipte ChIP olarak bilinir. Kromatine bağlanan proteinler , genellikle formaldehit ile fiksasyon yoluyla in vivo olarak çapraz bağlanır . Kromatin daha sonra parçalanır ve ilgilenilen proteine özgü antikorlara maruz bırakılır . Bu kompleksler daha sonra çökeltilir. DNA daha sonra izole edilir ve saflaştırılır. Geleneksel DNA mikrodizileri ile, immüno-çökeltilmiş DNA, temsili genom bölgelerini kapsayacak şekilde tasarlanmış probları içeren çipe hibritlenir. Örtüşen problar veya çok yakın mesafedeki problar kullanılabilir. Bu, yüksek çözünürlüklü tarafsız bir analiz sağlar. Bu avantajların yanı sıra, döşeme dizileri yüksek tekrarlanabilirlik gösterir ve genomun büyük bölümlerini kapsayan örtüşen sondalar ile döşeme dizileri, tekrarları barındıran protein bağlama bölgelerini sorgulayabilir. ChIP-çip deneyleri, maya, drosophila ve birkaç memeli türündeki genom boyunca transkripsiyon faktörlerinin bağlanma bölgelerini belirleyebilmiştir.
transkriptom haritalama
Döşeme dizilerinin bir başka popüler kullanımı, ifade edilen genleri bulmaktır. Genomik dizilerin ek açıklamaları için geleneksel gen tahmini yöntemleri, transkriptomu haritalamak için kullanıldığında, genlerin doğru bir yapısını üretmemek ve ayrıca transkriptleri tamamen kaybetmemek gibi sorunlarla karşılaşmıştır. Transkribe edilmiş genleri bulmak için cDNA'yı dizileme yöntemi, aynı zamanda, nadir veya çok kısa RNA moleküllerini tespit edememe gibi problemlerle de karşılaşır ve bu nedenle, yalnızca sinyallere yanıt olarak veya bir zaman çerçevesine özgü olarak aktif olan genleri tespit etmez. Döşeme dizileri bu sorunları çözebilir. Yüksek çözünürlük ve hassasiyet sayesinde küçük ve nadir moleküller bile tespit edilebilir. Probların örtüşen doğası ayrıca poliadenile edilmemiş RNA'nın saptanmasına izin verir ve gen yapısının daha kesin bir resmini üretebilir. Kromozom 21 ve 22 üzerinde daha önceki çalışmalar, transkripsiyon birimlerini tanımlamak için döşeme dizilerinin gücünü gösterdi. Yazarlar, tüm kromozomları kapsayan, 35bp aralıklı 25-mer problar kullandılar. Etiketli hedefler poliadenile edilmiş RNA'dan yapılmıştır. Tahmin edilenden çok daha fazla transkript buldular ve %90'ı açıklamalı ekzonların dışındaydı . Arabidopsis ile yapılan bir başka çalışmada , tüm genomu kapsayan yüksek yoğunluklu oligonükleotit dizileri kullanıldı . EST'ler ve diğer tahmin araçları tarafından tahmin edilenden 10 kat daha fazla transkript bulundu. Ayrıca , hiçbir genin aktif olarak eksprese edilmediğinin düşünüldüğü santromerik bölgelerde yeni transkriptler bulundu . Pek çok kodlamayan ve doğal antisens RNA , döşeme dizileri kullanılarak tanımlanmıştır.
MeDIP çipi
Metil-DNA immünopresipitasyonunun ardından döşeme dizisi, genom boyunca DNA metilasyon haritalaması ve ölçümüne izin verir. DNA, genomun birçok yerinde CG di-nükleotidlerinde sitozin üzerinde metillenir . Bu modifikasyon, en iyi anlaşılan kalıtsal epigenetik değişikliklerden biridir ve gen ekspresyonunu etkilediği gösterilmiştir. Bu bölgelerin haritalanması, eksprese edilen genlerin bilgisine ve ayrıca genom çapında epigenetik düzenlemeye katkıda bulunabilir. Döşeme dizisi çalışmaları, Arabidopsis genomunun ilk "metilomu" oluşturması için yüksek çözünürlüklü metilasyon haritaları üretti.
DNaz çipi
DNase çipi, aşırı duyarlı bölgeleri, DNaseI tarafından daha kolay bölünen açık kromatin segmentlerini tanımlamak için döşeme dizilerinin bir uygulamasıdır. DNaseI parçalama, boyutu yaklaşık 1.2 kb olan daha büyük parçalar üretir. Bu aşırı duyarlı bölgelerin, destekleyici bölgeler, güçlendiriciler ve susturucular gibi düzenleyici unsurları doğru bir şekilde tahmin ettiği gösterilmiştir. Tarihsel olarak, yöntem sindirilmiş parçaları bulmak için Southern lekeleme kullanır. Döşeme dizileri, araştırmacıların tekniği genom çapında bir ölçekte uygulamalarına izin verdi.
Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH)
Dizi tabanlı CGH, normal hücreler ve kanser hücreleri gibi DNA türleri arasındaki farklılıkları karşılaştırmak için teşhiste sıklıkla kullanılan bir tekniktir. CGH dizisi, tam genom ve ince döşeme için yaygın olarak iki tip döşeme dizisi kullanılır. Tüm genom yaklaşımı, yüksek çözünürlüklü kopya sayısı varyasyonlarını tanımlamada faydalı olacaktır. Öte yandan, ince döşenmiş dizi CGH, kesme noktaları gibi diğer anormallikleri bulmak için ultra yüksek çözünürlük üretecektir.
prosedür
Bir diziyi döşemek için birkaç farklı yöntem vardır. Gen ekspresyonunu analiz etmek için bir protokol, ilk olarak toplam RNA'nın izole edilmesini içerir. Bu daha sonra rRNA moleküllerinden arındırılır. RNA, çift sarmallı DNA'ya kopyalanır, daha sonra amplifiye edilir ve in vitro olarak cRNA'ya kopyalanır. Ürün, daha sonra parçalanan ve etiketlenen dsDNA'yı üretmek için üç kopyaya bölünür. Son olarak, örnekler döşeme dizisi çipine hibritlenir. Çipten gelen sinyaller bilgisayarlar tarafından taranır ve yorumlanır.
Veri analizi için çeşitli yazılım ve algoritmalar mevcuttur ve çipin üreticisine bağlı olarak faydaları farklılık gösterir. Affymetrix yongaları için, döşeme dizisinin (MAT) model tabanlı analizi veya döşeme dizilerinin (HAT) hipergeometrik analizi, etkili tepe arama algoritmalarıdır. NimbleGen çipleri için TAMAL, bağlanma yerlerini bulmak için daha uygundur. Alternatif algoritmalar, çalıştırması daha az karmaşık olan MA2C ve TileScope'u içerir. Ortak bağlama ters evrişim algoritması, Agilent yongaları için yaygın olarak kullanılır. Bağlanma bölgesinin dizi analizi veya genomun açıklaması gerekliyse, MEME, Gibbs Motif Sampler, Cis-regulatory element notation system ve Galaxy gibi programlar kullanılır.
Avantajlar ve dezavantajlar
Döşeme dizileri, genom çapında bir kapsamda protein bağlanmasını, gen ekspresyonunu ve gen yapısını araştırmak için tarafsız bir araç sağlar. Transkriptom ve metilomun incelenmesinde yeni bir anlayış düzeyine izin verirler.
Dezavantajlar, döşeme dizisi kitlerinin maliyetini içerir. Fiyatlar son birkaç yılda düşmüş olsa da, fiyat, memeliler ve diğer büyük genomlar için genom çapında döşeme dizilerini kullanmayı pratik hale getiriyor. Diğer bir konu da, ultra hassas algılama yeteneğinin ürettiği "transkripsiyonel gürültü"dür. Ayrıca, yaklaşım, dizi tarafından tanımlanan ilgili bölgelere açıkça tanımlanmış bir başlatma veya durdurma sağlamaz. Son olarak, diziler genellikle yalnızca kromozom ve konum numaralarını verir, genellikle dizilemeyi ayrı bir adım olarak gerektirir (ancak bazı modern diziler dizi bilgisi verir.)