çip üzerinde çip - ChIP-on-chip
Çipte ChIP ( ChIP-chip olarak da bilinir ), kromatin immünopresipitasyonunu ('ChIP') DNA mikrodizisi ( "çip" ) ile birleştiren bir teknolojidir . Normal ChIP gibi , çip üzerinde ChIP , proteinler ve DNA arasındaki etkileşimleri in vivo araştırmak için kullanılır . Spesifik olarak, genom çapında bir temelde DNA bağlayıcı proteinler için bağlanma bölgelerinin toplamı olan cistromun tanımlanmasına izin verir . Hemen hemen tüm ilgili proteinler için bağlanma bölgelerinin yerlerini belirlemek için tam genom analizi gerçekleştirilebilir. Tekniğin adından da anlaşılacağı gibi, bu tür proteinler genellikle kromatin bağlamında çalışan proteinlerdir . Bu sınıfın en belirgin temsilcileri, transkripsiyon faktörleri , orijin tanıma kompleksi proteini (ORC) gibi replikasyonla ilgili proteinler , histonlar , bunların varyantları ve histon modifikasyonlarıdır.
Çipte ChIP'in amacı, genomdaki fonksiyonel elementlerin tanımlanmasına yardımcı olabilecek protein bağlama bölgelerini bulmaktır . Örneğin, ilgili bir protein olarak bir transkripsiyon faktörünün olması durumunda, genom boyunca transkripsiyon faktörü bağlanma bölgeleri belirlenebilir. Diğer proteinler, promotör bölgelerinin , arttırıcıların , baskılayıcıların ve susturucu elementlerin , yalıtkanların , sınır elementlerinin ve DNA replikasyonunu kontrol eden dizilerin tanımlanmasına izin verir . Histonlar ilgi konusu ise, modifikasyonların dağılımının ve lokalizasyonlarının düzenleme mekanizmalarına yeni bakış açıları sunabileceğine inanılmaktadır .
Çip üzerinde ChIP'in tasarlandığı uzun vadeli hedeflerden biri, çeşitli fizyolojik koşullar altında tüm protein-DNA etkileşimlerini listeleyen (seçilmiş) organizmaların bir kataloğunu oluşturmaktır . Bu bilgi nihayetinde gen regülasyonu, hücre proliferasyonu ve hastalık progresyonunun arkasındaki makinelerin anlaşılmasına yardımcı olacaktır . Bu nedenle, çip üzerinde ChIP, hem nükleotid düzeyinde genomun düzenlenmesi hakkındaki bilgimizi tamamlama potansiyelini hem de epigenetik üzerine araştırmalar tarafından yayılan daha yüksek bilgi ve düzenleme seviyelerine ilişkin bilgileri tamamlama potansiyeli sunar .
Teknolojik platformlar
Çip üzerinde ChIP deneyleri yapmak için teknik platformlar, DNA mikrodizileri veya "çiplerdir" . Çeşitli özelliklere göre sınıflandırılabilir ve ayırt edilebilirler:
Prob tipi : DNA dizileri, mekanik olarak lekelenmiş cDNA'ları veya PCR ürünlerini , mekanik olarak lekelenmiş oligonükleotitleri veya yerinde sentezlenen oligonükleotitleri içerebilir . Mikrodizilerin ilk versiyonları, eksprese edilmiş genomik bölgelerden ( açık okuma çerçeveleri, yani ORF'ler) RNA'ları tespit etmek için tasarlandı . Bu tür diziler, gen ekspresyon profillerini incelemek için mükemmel bir şekilde uygun olsa da , bu tekniğe göre "ilginç" proteinlerin çoğu intergenik bölgelere bağlandığından, ChIP deneylerinde sınırlı öneme sahiptirler . Günümüzde, özel yapım diziler bile bir deneyin gereksinimlerine uyacak şekilde tasarlanabilir ve ince ayar yapılabilir. Ayrıca, herhangi bir nükleotid dizisi, hem geni hem de intergenik bölgeleri kapsayacak şekilde sentezlenebilir.
Prob boyutu : cDNA dizilerinin ilk versiyonu, yaklaşık 200bp'lik bir prob uzunluğuna sahipti. En son dizi sürümleri, 70- (Microarrays, Inc.) ila 25-mers ( Affymetrix ) kadar kısa oligolar kullanır . (Şubat 2007)
Prob bileşimi : Döşemeli ve döşemesiz DNA dizileri vardır. Döşemesiz diziler, uzaysal olmayan kriterlere göre seçilen probları kullanır, yani prob olarak kullanılan DNA dizilerinin genomda sabit mesafeleri yoktur. Bununla birlikte, döşenmiş diziler, bir genomik bölge (hatta bütün bir genom) seçer ve onu eşit parçalara böler. Böyle bir bölgeye kiremitli yol denir. Her bir komşu parça çifti arasındaki ortalama mesafe (her parçanın merkezinden ölçülür) döşenen yolun çözünürlüğünü verir. Bir yol örtüşen, uçtan uca veya aralıklı olabilir.
Dizi boyutu : Chip-on-Chip için kullanılan ilk mikrodiziler, maya genomundan tüm ORF'leri ve intergenik bölgeleri temsil eden yaklaşık 13.000 benekli DNA segmenti içeriyordu. Günümüzde Affymetrix, 5bp çözünürlüğe sahip (tüm 3.2 milyon probun tamamında) tam genomlu kiremitli maya dizileri sunmaktadır. İnsan genomu için döşenmiş diziler de giderek daha güçlü hale geliyor. Sadece bir örnek vermek gerekirse, Affymetrix yaklaşık 90 milyon problu yedi diziden oluşan bir dizi sunar ve insan genomunun tekrarlanmayan tam kısmını yaklaşık 35bp'lik bir aralıkla kapsar. (Şubat 2007) Çip üzerinde ChIP deneylerini çalıştırmak için gerçek mikrodizinin yanı sıra başka donanım ve yazılım ekipmanı gereklidir. Genellikle bir şirketin mikrodizilerinin başka bir şirketin işleme donanımı tarafından analiz edilemeyeceği bir durumdur. Bu nedenle, bir dizi satın almak, ilgili iş akışı ekipmanının da satın alınmasını gerektirir. En önemli unsurlar, diğerlerinin yanı sıra, hibridizasyon fırınları, çip tarayıcılar ve ham verilerin sonraki sayısal analizi için yazılım paketleridir.
Çipte ChIP deneyinin iş akışı
Biyolojik bir soruyla başlayarak, bir çip üzerinde ChIP deneyi üç ana adıma ayrılabilir: Birincisi, uygun diziyi ve prob tipini seçerek deneyi kurmak ve tasarlamaktır. İkincisi, asıl deney ıslak laboratuvarda gerçekleştirilir. Son olarak, döngünün kuru laboratuvar bölümü sırasında, toplanan veriler ya ilk soruyu yanıtlamak ya da döngünün yeniden başlayabilmesi için yeni sorulara yol açmak için analiz edilir.
İş akışının ıslak laboratuvar kısmı
İlk adımda, ilgilenilen protein (POI), in vitro ortamda bağlandığı DNA bölgesi ile çapraz bağlanır . Genellikle bu, ısıyla tersine çevrilebilen yumuşak bir formaldehit fiksasyonu ile yapılır .
Daha sonra hücreler parçalanır ve DNA sonikasyon veya mikrokokal nükleaz kullanılarak kesilir . Bu, normalde 1 kb veya daha az uzunlukta olan çift sarmallı DNA parçaları parçalarıyla sonuçlanır. POI'ye çapraz bağlı olanlar bir POI-DNA kompleksi oluşturur.
Sonraki adımda, POI'ye özgü bir antikor kullanılarak DNA fragmanları setinden yalnızca bu kompleksler filtrelenir . Antikorlar katı bir yüzeye eklenebilir, manyetik bir boncuk veya çapraz bağlı komplekslerin ve bağlanmamış parçaların ayrılmasına izin veren başka bazı fiziksel özelliklere sahip olabilir. Bu prosedür esasen proteinin bir immünopresipitasyonudur (IP). Bu, etikete karşı bir antikora sahip etiketli bir protein (örn. FLAG , HA , c-myc) veya doğal proteine yönelik bir antikor kullanılarak yapılabilir.
POI-DNA komplekslerinin çapraz bağlanması tersine çevrilir (genellikle ısıtma ile) ve DNA zincirleri saflaştırılır. İş akışının geri kalanı için İÇN artık gerekli değildir.
Bir amplifikasyon ve denatürasyon adımından sonra, tek iplikli DNA fragmanları Cy5 veya Alexa 647 gibi bir floresan etiketle etiketlenir.
Son olarak, fragmanlar, ilgilenilen genomik kısmı kaplayan kısa, tek iplikli dizilerle lekelenen DNA mikrodizisinin yüzeyi üzerine dökülür. Etiketli bir fragman dizi üzerinde tamamlayıcı bir fragman "bulduğunda", hibritleşecek ve tekrar çift sarmallı bir DNA fragmanı oluşturacaktır.
İş akışının kuru laboratuvar bölümü
Hibridizasyona izin verecek kadar geniş bir zaman diliminden sonra dizi floresan ışığı ile aydınlatılır. Dizideki etiketli parçalardan birine hibritlenen sondalar, bir kamera tarafından yakalanan bir ışık sinyali yayar. Bu görüntü, iş akışının kalan kısmı için tüm ham verileri içerir.
Sahte renkli görüntü olarak kodlanan bu ham verilerin, gerçek analiz yapılmadan önce sayısal değerlere dönüştürülmesi gerekir. Ham verilerin analizi ve bilgi çıkarımı, çipte ChIP deneyleri için genellikle en zorlu kısım olmaya devam ediyor. Sorunlar uygun son olarak arka plan gürültüsünü çıkarmak için uygun yöntemlere, ilk çip Okuması arasında değişen, iş akışının bu bölümü boyunca ortaya çıkan ve algoritmalar normalize verileri ve sonraki için kullanılabilir hale istatistiksel analiz daha sonra umutla a yol, deneyin ele almaya çalıştığı biyolojik sorunun daha iyi anlaşılması. Ayrıca, farklı dizi platformları ve aralarındaki standardizasyon eksikliği nedeniyle, veri depolama ve alışverişi büyük bir sorundur. Genel olarak konuşursak, veri analizi üç ana adıma ayrılabilir:
İlk adım sırasında, diziden yakalanan floresan sinyalleri, aynı veya ikinci bir çipten türetilen kontrol sinyalleri kullanılarak normalleştirilir. Bu tür kontrol sinyalleri, dizideki hangi probların doğru bir şekilde hibridize edildiğini ve hangilerinin spesifik olmayan bir şekilde bağlandığını söyler.
İkinci adımda, genom boyunca POI ile zenginleştirilmiş bölgeleri tanımlamak için verileri ve IP fraksiyon verilerini kontrol etmek için sayısal ve istatistiksel testler uygulanır. Aşağıdaki üç yöntem yaygın olarak kullanılmaktadır: medyan yüzdelik sıralaması , tek dizi hatası ve kayan pencere . Bu yöntemler genellikle düşük yoğunluklu sinyallerin nasıl işlendiği, ne kadar arka plan gürültüsünün kabul edildiği ve hesaplama sırasında verilerin hangi özelliğinin vurgulandığı konusunda farklılık gösterir. Yakın geçmişte, sürgülü pencere yaklaşımı tercih ediliyor gibi görünüyor ve genellikle en güçlü olarak tanımlanıyor.
Üçüncü adımda, bu bölgeler daha fazla analiz edilir. Örneğin, POI bir transkripsiyon faktörü olsaydı, bu tür bölgeler onun bağlanma bölgelerini temsil ederdi. Müteakip analiz, genomun işlevsel açıklamalarına izin vermek için nükleotid motifleri ve diğer kalıpları çıkarmak isteyebilir.
Güçlülükler ve zayıflıklar
Döşenmiş dizileri kullanarak , çipte ChIP , genom çapında haritaların yüksek çözünürlüğüne izin verir. Bu haritalar, transkripsiyon faktörleri ve ayrıca kromatin modifikasyonları gibi birçok DNA bağlayıcı proteinin bağlanma bölgelerini belirleyebilir.
Çipte ChIP, genomik alanında güçlü bir teknik olabilse de, çok pahalıdır. Çipte ChIP kullanan yayınlanmış çalışmaların çoğu, biyolojik olarak anlamlı haritalar sağlamak için deneylerini en az üç kez tekrarlar. DNA mikrodizilerinin maliyeti, genellikle bir laboratuvarın çip üzerinde ChIP deneyine devam edip etmeyeceği konusunda sınırlayıcı bir faktördür. Başka bir sınırlama, elde edilebilecek DNA parçalarının boyutudur. Çipte ChIP protokollerinin çoğu, DNA'yı küçük parçalara ayırma yöntemi olarak sonikasyonu kullanır. Bununla birlikte, sonikasyon, 200 bp'lik bir minimum parça boyutu ile sınırlıdır. Daha yüksek çözünürlüklü haritalar için, daha küçük fragmanlar, tercihen tek nükleozom çözünürlüğü elde etmek için bu sınırlamanın üstesinden gelinmelidir . Daha önce bahsedildiği gibi, dizilerden üretilen büyük miktardaki verinin istatistiksel analizi bir zorluktur ve normalleştirme prosedürleri, yapaylıkları en aza indirmeyi ve neyin gerçekten biyolojik olarak önemli olduğunu belirlemeyi amaçlamalıdır. Şimdiye kadar, memeli genomlarına uygulama, örneğin tekrarlar tarafından işgal edilen genomun önemli bir yüzdesi nedeniyle büyük bir sınırlama olmuştur. Bununla birlikte, çip üzerinde ChIP teknolojisi ilerledikçe, yüksek çözünürlüklü tam memeli genom haritaları ulaşılabilir hale gelmelidir.
Çipte ChIP için kullanılan antikorlar önemli bir sınırlayıcı faktör olabilir. Çip üzerinde ChIP , epitopunu serbest solüsyonda ve ayrıca sabit koşullar altında tanıması gereken oldukça spesifik antikorlar gerektirir . Çapraz bağlı kromatini başarılı bir şekilde immüno - çökelttiği kanıtlanırsa , " ChIP dereceli " olarak adlandırılır . ChIP dereceli antikorlar sağlayan şirketler arasında Abcam , Cell Signaling Technology , Santa Cruz ve Upstate bulunur. Özgüllük sorununun üstesinden gelmek için, ilgilenilen protein, antikorlar tarafından tanınan FLAG veya HA gibi bir etikete kaynaştırılabilir . Çipte ChIP'ye antikor gerektirmeyen bir alternatif DamID'dir .
H3 tri metil K4 gibi spesifik bir histon modifikasyonuna karşı antikorlar da mevcuttur . Daha önce bahsedildiği gibi, bu antikorların ve çipte ChIP'nin kombinasyonu, histon modifikasyon modellerinin tüm genom analizini belirlemede son derece güçlü hale geldi ve histon kodu ve epigenetiği anlamamıza büyük katkı sağlayacak .
DNA bağlayıcı proteinlerin spesifik olmayan doğasını gösteren bir çalışma, PLoS Biology'de yayınlandı. Bu, işlevsel uygunluğun alternatif onayının herhangi bir ChIP çip deneyinde gerekli bir adım olduğunu gösterir.
Tarih
Tomurcuklanan maya kromozomu III boyunca kohezin dağılımını analiz etmek için 1999'da ilk çip üzerinde ChIP deneyi yapıldı . Genom tam olarak temsil edilmemiş olsa da, bu çalışmadaki protokol, daha sonraki çalışmalarda kullanılanlarla eşdeğer kalır. Genomun tüm ORF'lerini kullanan (yine de eksik kalan, genler arası bölgelerin eksik olduğu) çip üzerinde ChIP tekniği, 2000 ve 2001'de yayınlanan üç makalede başarıyla uygulandı. Yazarlar, tomurcuklanmadaki bireysel transkripsiyon faktörleri için bağlanma bölgelerini belirlediler. maya Saccharomyces cerevisiae . 2002 yılında, Richard Young'ın grubu, mayada bir c-Myc etiketleme sistemi kullanarak 106 transkripsiyon faktörünün genom çapındaki pozisyonlarını belirledi. Memeli çip üzerinde çip tekniğinin ilk gösterimi, zayıf ve güçlü E2F bağlanma bölgesi içeren dokuz kromatin fragmanının izolasyonunun Peggy Farnham'ın laboratuvarı tarafından Michael Zhang'ın laboratuvarı ile işbirliği içinde yapıldığını ve 2001'de yayınlandığını bildirdi. Bu çalışma birkaç ay sonra takip edildi. Young laboratuvarı ile E2F hedeflerinin DNA hasar kontrol noktasının bileşenlerini kodladığını ve onarım yollarının yanı sıra kromatin düzeneğinde yer alan faktörleri ilk kez göstermek için çipte ChIP tekniğini kullanan Brian Dynlacht'ın laboratuvarı ile işbirliği içinde /yoğunlaştırma, kromozom ayrımı ve mitotik iğ kontrol noktası Çip üzerinde ChIP için diğer uygulamalar arasında DNA replikasyonu , rekombinasyon ve kromatin yapısı bulunur. O zamandan beri, çip üzerinde ChIP, genom çapında histon modifikasyonları haritalarını ve daha birçok transkripsiyon faktörünü belirlemede güçlü bir araç haline geldi. Memeli sistemlerinde çip üzerinde çip, büyük ve tekrarlayan genomlar nedeniyle zor olmuştur. Bu nedenle, memeli hücrelerinde yapılan birçok çalışma, transkripsiyon faktörlerini bağladığı tahmin edilen ve tüm genomu analiz etmeyen seçilmiş promotör bölgelerine odaklanmıştır. Bununla birlikte, tüm memeli genom dizileri son zamanlarda Nimblegen gibi şirketlerden ticari olarak temin edilebilir hale geldi. Gelecekte, çip üzerinde ChIP dizileri gittikçe daha gelişmiş hale geldikçe, memeliler için DNA bağlayıcı proteinlerin ve kromatin bileşenlerinin yüksek çözünürlüklü tam genom haritaları daha ayrıntılı olarak analiz edilecektir.
alternatifler
2007'de tanıtılan ChIP dizilimi (ChIP-seq), ilgili proteinleri DNA'ya çapraz bağlamak için kromatin immünopresipitasyon kullanan bir teknolojidir, ancak daha sonra bir mikro dizi kullanmak yerine, lokalize etmek için daha doğru, daha yüksek verimli dizileme yöntemini kullanır. etkileşim noktaları.
DamID , antikor gerektirmeyen alternatif bir yöntemdir.
ChIP-exo , tek baz çifti çözünürlüğü elde etmek için eksonükleaz tedavisini kullanır.
CUT&RUN dizileme , ChIP'nin bazı teknik sınırlamalarını ele almak için hedeflenen enzimatik bölünme ile antikor tanımayı kullanır.
Referanslar
daha fazla okuma
- Johnson, BİZ; Li, W.; Meyer, CA; Gottardo, R.; Carroll, JS; Kahverengi, M.; Liu, XS (2006). "ChIP-chip için döşeme dizilerinin model tabanlı analizi" . Ulusal Bilimler Akademisi Bildirileri . 103 (33): 12457–12462. Bibcode : 2006PNAS..10312457J . doi : 10.1073/pnas.0601180103 . ISSN 0027-8424 . PMC 1567901 . PMID 16895995 .
- Benoukraf, Touati ; Cauchy, Pierre; Fenouil, Romain; Jeanniard, Adrien; Koç, Frederic; Jaeger, Sebastien; Hırsız, Denis; Imbert, Jean; Andrau, Jean-Christophe; Spicuglia, Salvatore; Ferrier, Pierre (2009). "CoCAS: çip üzerinde bir ChIP analiz paketi" . Biyoinformatik . 25 (7): 954-955. doi : 10.1093/biyoinformatik/btp075 . ISSN 1460-2059 . PMC 2660873 . PMID 19193731 .
Dış bağlantılar
- http://www.genome.gov/10005107 ENCODE projesi
- Amkor Technology'den Chip-on-Chip (CoC) Paket Bilgileri