Dijital holografik mikroskopi - Digital holographic microscopy

Gerçek zamanlı olarak ölçülen kimyasal aşındırma
Şekil 1. Hücre detaylarının DHM faz kayması görüntüsü.
Yüzey kalitesi ölçümü

Dijital holografik mikroskopi ( DHM ), mikroskopiye uygulanan dijital holografidir . Dijital holografik mikroskopi, nesnenin yansıtılan görüntüsünü kaydetmemesiyle kendisini diğer mikroskopi yöntemlerinden ayırır. Bunun yerine, nesneden kaynaklanan ışık dalgası ön bilgisi , bir bilgisayarın sayısal bir yeniden yapılandırma algoritması kullanarak nesne görüntüsünü hesapladığı bir hologram olarak dijital olarak kaydedilir . Geleneksel mikroskopta görüntü oluşturan mercek , böylece bir bilgisayar algoritması ile değiştirilir. Dijital holografik mikroskopi ile yakından ilişkili diğer mikroskopi yöntemleri, interferometrik mikroskopi , optik koherens tomografi ve kırınım fazı mikroskobudur. Tüm yöntemlerde ortak olan, genlik (yoğunluk) ve faz bilgisi elde etmek için bir referans dalga cephesinin kullanılmasıdır . Bilgi, bir dijital görüntü sensörüne veya nesnenin bir görüntüsünün bir bilgisayar tarafından oluşturulduğu (yeniden oluşturulduğu) bir fotodedektör tarafından kaydedilir. Referans dalga cephesi kullanmayan geleneksel mikroskopide, yalnızca yoğunluk bilgisi kaydedilir ve nesneyle ilgili temel bilgiler kaybolur.

Holografi, elektron mikroskobu geliştirmek için Dennis Gabor tarafından icat edildi . Bununla birlikte, bu alanda hiçbir zaman çok fazla beton ve endüstriyel uygulama bulamadı.

Aslında, DHM çoğunlukla ışık mikroskobuna uygulanmıştır. Bu alanda, teknik numunelerin 3 boyutlu karakterizasyonu için benzersiz uygulamalar göstermiş ve canlı hücrelerin kantitatif karakterizasyonunu mümkün kılmıştır. Gelen malzeme bilimi , DHM rutin akademik ve endüstriyel laboratuvarlarında araştırma için kullanılır. Uygulamaya bağlı olarak, mikroskoplar hem iletim hem de yansıma amacıyla yapılandırılabilir. DHM, kısa bir zaman aralığında bilgi alınması gerektiğinde teknik numunelerin 4D (3D + zaman) karakterizasyonu için benzersiz bir çözümdür. Gürültülü ortamlarda, titreşimlerin varlığında, numuneler hareket ettiğinde veya numunelerin şekli mekanik, elektriksel veya manyetik kuvvetler, kimyasal erozyon veya birikim ve buharlaşma gibi dış uyaranlardan dolayı değiştiğinde yapılan ölçümler için geçerlidir. Yaşam bilimlerinde, DHM genellikle iletim modunda yapılandırılır. Bu, canlı hücrelerin kantitatif faz görüntüleme (QPI) olarak da adlandırılan etiketsiz kantitatif faz ölçümünü (QPM) mümkün kılar. Ölçümler hücreleri etkilemez, uzun süreli çalışmalara olanak sağlar. Aşağıdaki " Canlı hücre görüntüleme " bölümünde açıklandığı gibi, temeldeki birçok biyolojik sürece yorumlanabilecek bilgiler sağlar .

Çalışma prensibi

Şekil 2. DHM'nin tipik optik kurulumu.

Gerekli girişim desenini , yani hologramı yaratmak için , aydınlatmanın tutarlı (tek renkli) bir ışık kaynağı, örneğin bir lazer olması gerekir. Şekil 2'de görülebileceği gibi, lazer ışığı bir nesne ışını ve bir referans ışını olarak ikiye ayrılır. Genişletilmiş nesne ışını, nesne dalga cephesini oluşturmak için numuneyi aydınlatır. Nesne dalga cephesi bir mikroskop objektifi tarafından toplandıktan sonra, nesne ve referans dalga cepheleri, müdahale etmek ve hologramı oluşturmak için bir ışın ayırıcı ile birleştirilir . Dijital olarak kaydedilen hologramı kullanan bir bilgisayar, dijital bir lens gibi davranır ve sayısal bir yeniden yapılandırma algoritması kullanarak nesne dalgası cephesinin görüntülenebilir bir görüntüsünü hesaplar.

Genellikle, nesne dalga cephesini toplamak için bir mikroskop hedefi kullanılır. Ancak, mikroskop objektifi görüntü oluşturmak için değil, sadece ışık toplamak için kullanıldığından, basit bir mercekle değiştirilebilir. Biraz daha düşük bir optik çözünürlük kabul edilebilirse, mikroskop hedefi tamamen kaldırılabilir.

Dijital holografi , optik kuruluma bağlı olarak eksen dışı Fresnel , Fourier , görüntü düzlemi , hat içi , Gabor ve faz kaydırmalı dijital holografi gibi farklı tatlarda gelir . Ancak temel ilke aynıdır; bir hologram kaydedilir ve bir görüntü bir bilgisayar tarafından yeniden oluşturulur.

Dijital holografik mikroskopinin yanal optik çözünürlüğü , geleneksel ışık mikroskobunun çözünürlüğüne eşdeğerdir . DHM, geleneksel ışık mikroskobu ile aynı şekilde sayısal açıklık tarafından kırınımla sınırlıdır . Ancak DHM, mükemmel bir eksenel (derinlik) çözünürlük sunar. Yaklaşık 5 nm'lik bir eksenel doğruluk bildirilmiştir.

Avantajlar

Şekil 3. DHM faz kayması görüntüsünün (solda) ve faz kontrast mikroskobu görüntüsünün (sağda) karşılaştırılması.

Faz kaymalı görüntüler
Sıradan parlak alan görüntüsünün yanı sıra bir faz kayması görüntüsü de oluşturulur. Faz kayması görüntüsü, dijital holografik mikroskopi için benzersizdir ve optik mesafe hakkında ölçülebilir bilgiler verir . Yansıma DHM'de faz kayması görüntüsü , nesnenin bir topografya görüntüsünü oluşturur.

Canlı biyolojik hücreler gibi şeffaf nesneler, geleneksel olarak bir faz kontrast mikroskobunda veya bir diferansiyel girişim kontrast mikroskobunda görüntülenir . Bu yöntemler, faz kaydırma bilgisi ile parlak alan görüntüsünü bozarak faz kaydırmalı saydam nesneleri görselleştirir. Parlak alan görüntüsünü bozmak yerine, iletim DHM , nesnenin optik kalınlığını gösteren ayrı bir faz kayması görüntüsü oluşturur . Dijital holografik mikroskopi böylece şeffaf nesneleri görselleştirmeyi ve nicelleştirmeyi mümkün kılar ve bu nedenle nicel faz kontrast mikroskobu olarak da adlandırılır .

Canlı boyanmamış biyolojik hücrelerin geleneksel faz kontrastı veya parlak alan görüntüleri, Şekil 3 (sağda), görüntü analiz yazılımı ile analiz etmenin çok zor olduğunu kanıtlamıştır . Aksine, faz kayması görüntüleri, Şekil 3 (solda), CellProfiler gibi matematiksel morfolojiye dayalı görüntü analiz yazılımı tarafından kolayca bölümlere ayrılır ve analiz edilir .

3-boyutlu bilgi
Bir nesne görüntüsü, belirli bir odak mesafesinde hesaplanır . Ancak kaydedilen hologram gerekli tüm nesne dalgası ön bilgilerini içerdiğinden , yeniden oluşturma algoritmasında odak uzaklığı parametresini değiştirerek nesneyi herhangi bir odak düzleminde hesaplamak mümkündür . Aslında, hologram tam bir görüntü yığınını hesaplamak için gereken tüm bilgileri içerir . Nesne dalga cephesinin birden fazla açıdan kaydedildiği bir DHM sisteminde, nesnenin optik özelliklerini tam olarak karakterize etmek ve nesnenin tomografi görüntülerini oluşturmak mümkündür .

Dijital otofokus
Konvansiyonel otofokus , odaklanmış bir görüntü düzlemi bulunana kadar odak mesafesinin dikey olarak değiştirilmesiyle elde edilir. Tüm görüntü düzlemleri yığını tek bir hologramdan hesaplanabildiğinden, odak düzlemini dijital olarak seçmek için herhangi bir pasif otofokus yöntemini kullanmak mümkündür. Dijital holografinin dijital otomatik odaklama yetenekleri, herhangi bir dikey mekanik hareket olmaksızın yüzeyleri son derece hızlı bir şekilde tarama ve görüntüleme imkanı sunar. Tek bir hologramı kaydedip daha sonra farklı odak düzlemlerinde hesaplanan alt görüntüleri birbirine dikerek, nesnenin tam ve odaklanmış bir görüntüsü oluşturulabilir.

Optik sapma düzeltme
DHM sistemlerinde görüntü oluşturan bir lens bulunmadığından , geleneksel optik sapmalar DHM için geçerli değildir. Optik sapmalar, yeniden yapılandırma algoritmasının tasarımıyla "düzeltilir". Optik kurulumu gerçekten modelleyen bir yeniden yapılandırma algoritması, optik sapmalardan etkilenmeyecektir.

Düşük maliyetli
olarak optik mikroskop sistemleri, optik anormallikler geleneksel mikroskop amaç oluşturan karmaşık ve maliyetli bir görüntü halinde lens birleştirerek düzeltilir. Ayrıca, yüksek büyütmelerde dar odak derinliği , hassas mekanikler gerektirir. Bir DHM sistemi için gerekli bileşenler, ucuz optikler ve lazer diyot ve görüntü sensörü gibi yarı iletken bileşenlerdir . DHM'nin otomatik odaklama yetenekleriyle birlikte düşük bileşen maliyeti, DHM sistemlerinin çok düşük bir maliyetle üretilmesini mümkün kılar.

Uygulamalar

Şekil 4. İnsan kırmızı kan hücrelerinin DHM faz kayması görüntüsü .

Dijital holografik mikroskopi, bir dizi uygulama alanında başarıyla uygulanmıştır.

Canlı hücre görüntüleme

Bununla birlikte, DHM'nin biyolojik dokuyu invaziv olmayan bir şekilde görselleştirme ve nicelleştirme yeteneği nedeniyle, biyomedikal uygulamalar en çok ilgiyi çekmiştir. Biyomedikal uygulamalara örnekler:

  • Yapışkan hücre kültürlerinde etiketsiz hücre sayımı . Dijital holografik mikroskopi, hücre sayımı gerçekleştirmeyi ve hücre canlılığını doğrudan hücre kültürü odasında ölçmeyi mümkün kılar. Günümüzde en yaygın kullanılan hücre sayma yöntemleri olan hemasitometre veya Coulter sayacı , yalnızca süspansiyon halindeki hücrelerle çalışır.
  • Yapışkan hücre kültürlerinin etiketsiz canlılık analizi. Farklı hücre tiplerinde apoptotik süreci incelemek için dijital holografi kullanılmıştır . Apoptotik süreç sırasında meydana gelen kırılma indisi değişiklikleri DHM ile kolaylıkla ölçülebilir.
  • Etiketsiz hücre döngüsü analizi. Hücreler tarafından indüklenen faz kaymasının hücre kuru kütlesi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Hücre kuru kütlesi, hücre döngüsünün daha iyi anlaşılmasını sağlamak için hücre hacmi ve kırılma indisi gibi dijital holografi ile elde edilebilen diğer parametrelerle birleştirilebilir.
  • Hücrelerin etiketsiz morfoloji analizi. Dijital holografi, ne boyama ne de etiketleme kullanarak hücre morfolojisini incelemek için farklı bağlamlarda kullanılmıştır. Bu, hücre özelliklerinin değiştiği farklılaşma süreci gibi süreçleri takip etmek için kullanılabilir. DHM, otomatik bitki kök hücre izlemesi için de kullanılmış ve morfolojik parametreleri ölçerek iki tip kök hücre arasında ayrım yapmayı mümkün kılmıştır.
  • Serbest sinir hücresi çalışmalarını etiketleyin . Dijital holografik mikroskopi, etiketleme gerekmediğinden sinir hücrelerindeki bozulmamış süreçleri incelemeyi mümkün kılar. Hücresel dengesizliğin neden olduğu sinir hücrelerinin şişmesi ve şekil değiştirmesi kolayca incelendi.
Şekil 5. Boyanmamış, bölünen ve göç eden hücrelerin hızlandırılmış hali.
  • Etiketsiz yüksek içerik analizi . Floresan yüksek içerik analizi/taramasının birkaç dezavantajı vardır. Bu nedenle, faz kayması görüntülerine dayalı etiketsiz alternatifler önerilmiştir. DHM'nin geniş alanlarda hızla faz kayması görüntüleri elde etme yeteneği, hücre döngüsünün çok hızlı nicel karakterizasyonu ve spesifik farmakolojik ajanların etkileri için yeni olanaklar açar.
  • Kırmızı kan hücresi analizi. Faz kayması görüntüleri, kırmızı kan hücresi dinamiklerini incelemek için kullanılmıştır. Kırmızı kan hücresi hacmi ve hemoglobin konsantrasyonu,holografik mikroskopi ile tam kan hücresi sayımını kolaylaştırmak için absorpsiyon ve faz kayması görüntülerinden elde edilen bilgilerin birleştirilmesiyle ölçülmüştür. Ayrıca, faz kayması bilgisinin olgunlaşmamış kırmızı kan hücrelerini matürden ayırt ettiği ve boyanmamış retikülosit sayımınıkolaylaştırdığı gösterilmiştir.
  • Akış sitometrisi ve parçacık izleme ve karakterizasyonu. Dijital holografi ile oluşturulan görüntüler, fiili kayıttan sonra herhangi bir zamanda ve herhangi bir odak düzleminde kaydedilen hologramdan hesaplanır. Aynı hologramdan, ancak farklı odak düzlemlerinde hesaplanan birkaç görüntüyü birleştirerek, geleneksel ışık mikroskobu ile elde edilebilecek olandan çok daha üstün olanartan bir alan derinliği elde edilebilir. Artan alan derinliği, süspansiyon halindeyken hücrelerin ve parçacıkların morfolojisini görüntülemeyi ve karakterize etmeyi mümkün kılar. Gözlemler doğrudan bir mikroakışkan kanalda veya statik olarak bir gözlem odasında yapılabilir.
  • Hücre bölünmesi ve göçünün hızlandırılmış mikroskopisi . Dijital holografik mikroskopinin otomatik odaklama ve faz kaydırmalı görüntüleme yetenekleri, hücre göçü çalışmalarıiçin boyanmamış hücrelerin etiketsiz ve ölçülebilir hızlandırılmış video kliplerinizahmetsizce oluşturmayı mümkün kılar. Şekil 5'te, bölünen ve göç eden hücrelerin etiketsiz bir hızlandırılmış hali gösterilmektedir.
  • Tomografi çalışmaları. Dijital holografik mikroskopi, canlı dokunun derinliklerinde hücre altı hareketin etiketsiz ve ölçülebilir analizine izin verir.

Yüzey 3D topografisi

DHM, diğer birçok 3B optik profilometre (beyaz ışık interferometreleri, konfokal, odak değişimi, … ) gibi 3B yüzey topografyasının statik ölçümlerini gerçekleştirir. Birçok yüzeyin geri alınmasını, pürüzlülüğünü ve şeklini almayı sağlar. Çoklu dalga boylarının kullanılması, geleneksel faz kaydırmalı interferometrelerin l/4 limitinin üstesinden gelinmesini sağlar. Medikal implantlar, saat bileşenleri, mikro bileşenler, mikro optikler gibi birçok numune üzerinde uygulamalar gösterilmiştir.

Zaman çözümlü uygulamalar

Sıfırdan kendini onaran yüzey: gerçek zamanlı ölçüm

DHM, tek bir kamera çekimi ile tüm görüş alanı üzerinden 3B yüzey topografyasını ölçtüğü için, ne dikey ne de yanal taramaya gerek yoktur. Sonuç olarak, topografyanın dinamik değişiklikleri anlık olarak ölçülür. Çekim hızı yalnızca kamera çerçevesi ile sınırlıdır. Akıllı yüzey, kendi kendini iyileştiren yüzeyler, denge sistemleri değil, buharlaşma süreçleri, elektrodepozisyon, buharlaşma, kristalleşme, mekanik deformasyon gibi birçok numune türünde ölçümler gösterilmiştir.

MEMS

Stroboskopik modda 8 MHz'de ölçülen Ultrasonik Dönüştürücüler

Numune aydınlatması için lazer darbesini ve MEMS uyarımı ile kamera alımını senkronize etmek için bir stroboskopik elektronik ünite ile birlikte kullanılan DHM®, mikro sistemlerin uyarma aşaması boyunca 3D topografinin zaman dizilerini sağlar. Sabit bir frekansta elde edilen bu 3 boyutlu topografilerin zaman dizisinin analizi, titreşim haritası sağlar ve hareketin düzlem içi ve dışı olarak ayrıştırılmasını sağlar.

Uyarma frekansının taranması, yapısal rezonansların yanı sıra genlik ve faz Bode analizi sağlar. Diğerlerinin yanı sıra tarak tahrikli aktüatörler, mikro aynalar, ivmeölçerler, jiroskoplar, mikro pompalar, mikrofonlar, ultrasonik dönüştürücüler, konsollar ve yüzey akustik dalgaları gibi birçok MEMS türünde ölçümler kanıtlanmıştır.

Metroloji

DHM, yalnızca yükseklik ölçümü için dalga boylarını ifade eder. Bu nedenle DHM, herhangi bir dikey kalibrasyondan, mekanik parçanın hassas konumlandırılmasından, interferometrik piezo kontrolörün tekrarlanabilirliğinden, motorlu yer değiştirmeden veya sıvı kristal ekran taramasından bağımsız olarak çok yüksek tekrarlanabilirlik ve doğrusallıkla hassas yükseklik ölçümleri sağlar. Bu özellik, DHM'yi diğerleri arasında adım ve pürüzlülük sertifikasyonu için olağanüstü bir araç haline getirir. İletim sistemleri için mükemmel düzlük kalibrasyonu, optik yolda herhangi bir numune olmadan bir alım referans alınarak elde edilir. Yansıma tipi sistemlerin düzlük kalibrasyonu, mükemmel düz bir numunenin kullanılmasını gerektirir.

Endüstriyel muayene

Kalça protezinin otomatik ölçümü : yüzey pürüzlülüğü karakterizasyonu

Bilgi almak için gereken çok kısa süre, DHM'yi çevresel titreşimlere karşı çok sağlam kılar. Parçaların özellikle “uçuşta” ve “çevrimiçi” kalite kontrollerini sağlar. Özellikle implantların pürüzlülüğü, yarı iletken bileşenlerin yapısı, güneş enerjisi endüstrisi, endüstriyel metroloji ve diğerlerinin yanı sıra saat parçaları için uygulamalar gösterilmiştir.

Mikro optik

Mikro optik dizilerin hızlı ölçümü ve denetimi, diğer profilometrelerle yapılan ölçümlerle başarılı bir şekilde gösterilmiş ve karşılaştırılmıştır.

Dijital odaklamaya dayalı genişletilmiş odak derinliği algoritmaları, yüksek NA örnekleri için bile tam lens yüzeyi üzerinde keskin bir odak elde edilmesini sağlar. DHM, değişken lenslerin dinamik karakterizasyonuna da uygulanmıştır.

3D parçacık izleme

3D parçacık izleme, çok sayıda yayında [tamamlanacak] gösterilmiştir. Bir Z ölçüm yığını, bir dizi yayılma mesafesi kullanılarak tek bir hologramdan dijital olarak yeniden oluşturulabilir. Spesifik algoritmalar, her parçacık için en iyi odağına karşılık gelen mesafeyi belirlemeyi sağlar. Bu işlemin bir hologram dizilimi üzerinde gerçekleştirilmesi, parçacıkların yörüngelerinin belirlenmesini sağlar.

Tarih

Klasik holografinin fotoğrafik hologramını, hologramı dijital olarak kaydederek ve görüntüyü bir bilgisayarda sayısal olarak yeniden yapılandırarak değiştirmenin ilk raporları 1960'ların sonlarında ve 1970'lerin başında yayınlandı. 1980'lerin başında elektron mikroskobu için benzer fikirler önerildi . Ancak, bilgisayarlar çok yavaştı ve kayıt yetenekleri, dijital holografinin pratikte yararlı olması için çok zayıftı. İlk heyecandan sonra, dijital holografi, holografinin yaklaşık yirmi yıl önce yaşadığına benzer bir kış uykusuna yattı. (1960'larda "dijital holografi"nin bir hologramdan bir görüntü hesaplamak veya bir 3D modelden bir hologram hesaplamak anlamına gelebileceğini unutmayın. İkincisi, ara sırasında klasik holografiye paralel olarak gelişti ve bu süre zarfında "dijital holografi" holografi", şimdi bilgisayar tarafından üretilen holografi olarak bilinen şeyle eş anlamlıydı .)

1990'ların ortalarında, dijital görüntü sensörleri ve bilgisayarlar, görüntüleri belirli bir kalitede yeniden oluşturmak için yeterince güçlüydü, ancak yine de dijital holografinin meraktan öte bir şey olması için gerekli piksel sayısı ve yoğunluğundan yoksundu. O zamanlar, dijital görüntü sensörlerini yönlendiren pazar, öncelikle düşük çözünürlüklü videoydu ve bu nedenle bu sensörler yalnızca PAL , NTSC veya SECAM çözünürlüğü sağlıyordu. Bu, 21. yüzyılın başında, pahalı olmayan yüksek pikselli sensörlere olan talebi artıran dijital hareketsiz görüntü kameralarının piyasaya sürülmesiyle aniden değişti . 2010 itibariyle, uygun fiyatlı görüntü sensörleri 60 megapiksele kadar sahip olabilir. Buna ek olarak, CD ve DVD oynatıcı pazarı, uygun fiyatlı diyot lazerlerin ve optiklerin geliştirilmesini sağlamıştır .

Işık mikroskobu için dijital holografinin kullanıldığına dair ilk raporlar 1990'ların ortalarında geldi. Ancak, 2000'li yılların başına kadar görüntü sensörü teknolojisi, makul kalitede görüntülere izin verecek kadar ilerlememişti. Bu süre zarfında, ilk ticari dijital holografik mikroskopi şirketleri kuruldu. Artan bilgi işlem gücü ve pahalı olmayan yüksek çözünürlüklü sensörler ve lazerlerin kullanımı ile dijital holografik mikroskopi günümüzde öncelikle yaşam bilimleri, oşinoloji ve metroloji alanlarında uygulama bulmaktadır .

Ayrıca bakınız

Referanslar

Dış bağlantılar

daha fazla okuma

Kitabın

  • Dijital holografi yöntemleri, LP Yaroslavskii ve NS Merzlyakov, Springer (1980)
  • Dijital Holografi ve Dijital Görüntü İşleme: İlkeler, Yöntemler, Algoritmalar , Leonid Yaroslavsky, Kluwer (2004)
  • Holografik İnterferometri El Kitabı: Optik ve Dijital Yöntemler , Thomas Kreis, Wiley (2004)
  • Dijital Holografi , U. Schnars ve W. Jueptner, Springer (2005)
  • Dijital Holografi ve Üç Boyutlu Ekran: İlkeler ve Uygulamalar , Ting-Chung Poon (Editör), Springer (2006)
  • Dijital Holografi Mikroskopi uygulamaları: Üç Boyutlu Nesne Analizi ve İzleme , Cedric Schockaert, VDM Verlag (2009)
  • Faz Mikroskobik Nesnelerin Holografik Mikroskobu: Teori ve Uygulama Tatyana Tishko, Tishko Dmitry, Titar Vladimir, World Scientific (2010)
  • Hücrelerin ve Dokuların Kantitatif Faz Görüntülemesi Gabriel Popescu, McGraw-Hill (2011)
  • Dijital Holografik Mikroskopi: İlkeler, Teknikler ve Uygulamalar , Myung K. Kim, Springer (2011)
  • Tutarlı Işık Mikroskobu: Görüntüleme ve Kantitatif Faz Analizi , Pietro Ferraro, Springer (2011) tarafından düzenlendi
  • MEMS ve Microsystem Metrology için Dijital Holografi Erdal Çayırcı, Wiley (2011)
  • Dijital Holografi İçin Görüntü İşleme , Karen Molony, VDM Verlag (2011)
  • Pascal Picart ve Jun-chang Li, Wiley (2012) tarafından Dijital Holografi

İncelemeler

Özellik sorunları