plazmit - Ti plasmid

Ti plazmidinin yapısı

Bir tümör indükleyici (Ti) plazmiti , A. tumefaciens , A. rhizogenes , A. rubi ve A. vitis dahil olmak üzere Agrobacterium'un patojenik türlerinde bulunan bir plazmittir .

Evrimsel olarak, Ti plazmidi, birçok Alphaproteobacteria türü tarafından taşınan bir plazmit ailesinin parçasıdır . Bu plazmit ailesinin üyeleri, repABC gen kaseti olarak bilinen ve plazmitin replikasyonuna , hücre bölünmesi sırasında plazmitin yavru hücrelere bölünmesine ve aynı zamanda plazmitin korunmasına aracılık eden, korunmuş bir DNA bölgesinin varlığı ile tanımlanır . bir hücrede düşük kopya sayıları. Ti plazmitlerinin kendileri, molekül tipine veya opine göre farklı kategorilere ayrılırlar , bakterilerin bir enerji kaynağı olarak parçalanmasına izin verirler.

Bu Ti plazmitinin varlığı, bakterilerin bitkilerde taç safra hastalığına neden olması için gereklidir. Bu da dahil olmak üzere Ti plazmidi bazı önemli bölgeleri ile kolaylaştırılır vir bölgesi, virülans genlerine için kodlar, ve transfer DNA Ti plazmidin bir kesittir (T-DNA) bölgesi, transfer yoluyla konjugasyon konakçı bitkiye Hücreler, bir yaralanma bölgesinden sonra bakteri tarafından algılanır. Bu bölgeler, T-DNA'nın konukçu bitki hücrelerine verilmesine izin veren özelliklere sahiptir ve konukçu bitki hücresini, bitki hormonları (örneğin, oksinler , sitokininler ) ve opinler gibi moleküllerin sentezine ve taç safra tümörlerinin oluşumuna neden olacak şekilde modifiye edebilir .

Ti plazmidinin T-DNA bölgesi bakterilerden bitki hücrelerine aktarılabildiğinden, DNA'nın krallıklar arasında transferi için heyecan verici bir yolu temsil etti ve Ti plazmiti ve biyomühendislikte olası kullanımları hakkında büyük miktarda araştırma yapılmasını teşvik etti.

Adlandırma ve sınıflandırma

Ti plazmiti, Alphaproteobacteria'da bulunan RepABC plazmit ailesinin bir üyesidir . Bu plazmitler genellikle 100kbp ila 2Mbp arasında değişen boyut olarak nispeten büyüktür. Çoğaltmaları tek bir sitede başladığından, genellikle replikonlar olarak da adlandırılırlar . Bu ailenin üyeleri, karakteristik bir repABC gen kasetine sahiptir. Bu ailenin bir diğer dikkate değer üyesi, A. rhizogenes tarafından taşınan ve kıllı kök hastalığı olarak bilinen başka bir bitki hastalığına neden olan kök indükleyici (Ri) plazmitidir .

Ti plazmitlerinin önemli bir özelliği, konukçu bitki hücrelerinde çeşitli amino asitlerin veya şeker fosfatların türevleri olan opinlerin üretimini yönlendirme yetenekleridir . Bu görüşler daha sonra , Ti plazmidinde kodlanmış genleri kullanarak ilgili görüşleri katabolize eden, enfekte eden bakteriler için bir besin maddesi olarak kullanılabilir .

Bu duruma göre, Ti plazmidleri bunlar, yani, katabolize farzetmek türüne göre sınıflandırılmaktadır: nopalin- , oktopin- veya şeker fosfat türevleri, amino asit türevleri ya da agrocinopine tipi vardır mannityl-türleri.

Tarihsel keşif

A. tumefaciens'in bitkilerdeki gal tümörlerinin nedeni olarak tanımlanması, taç gal hastalığının moleküler temeline ilişkin anlayışların önünü açmıştır.

Konak bitki hücreleri üzerinde bir genetik etkinin ilk göstergesi, 1942-1943'te geldi, burada ikincil tümörlerin bitki hücrelerinin içinde herhangi bir bakteri hücresi bulunmadığı bulundu. Bununla birlikte, bu tümör hücreleri, enfekte eden bakteri suşu tarafından metabolize edilen opinler üretme yeteneğine sahipti. Önemli olarak, ilgili opinlerin üretimi, bitki türünden bağımsız olarak ve bazen sadece taç gal dokularında meydana geldi, bu da bakterilerin opin sentezine izin vermek için bazı genetik materyalleri konakçı bitki hücrelerine aktardığını gösteriyor.

Ancak DNA aktarımının nasıl ve ne ölçüde gerçekleştiği açık bir soru olarak kaldı. A. tumefaciens DNA'sının tek başına eklenmesi bitkilerde tümörlere neden olmazken, çok az A. tumefaciens DNA'sının konukçu bitki hücre genomuna entegre olduğu bulundu. Eklenmesi deoksiribonükleazlar degrade DNA'ya (DNases) de bitki tümör oluşumunu ve büyümesini önlemek için başarısız oldu. Bunlar, A. tumefaciens DNA'sının çok azının , eğer varsa, hastalığa neden olmak için konukçu bitki hücresine aktarıldığını ve eğer DNA gerçekten de bakteriden bitkiye aktarılırsa, bunun korumalı bir şekilde gerçekleşmesi gerektiğini ileri sürdü .

Daha sonra, onkojenik bakteri suşlarının, patojenik olmayan bakterileri, virülanstan sorumlu genlerin patojenik olmayan hücrelere aktarıldığı konjugasyon işlemi yoluyla patojenlere dönüştürebildiği bulundu. Bu patojenik yetenekte bir plazmitin rolü, büyük plazmitler sadece patojenik bakterilerde bulunduğunda ancak avirülent bakterilerde bulunmadığında daha da desteklendi. Sonunda, konukçu bitki hücrelerinde bakteriyel plazmit parçalarının tespiti kuruldu ve bunun enfeksiyonun genetik etkisinden sorumlu olan genetik materyal olduğunu doğruladı.

Ti plazmitinin tanımlanmasıyla birlikte Ti plazmitinin özelliklerini ve genetik materyalin Agrobacterium'dan bitki konakçısına nasıl aktarıldığını belirlemek için birçok çalışma yapılmıştır . Ti plazmitleri araştırmalarındaki bazı önemli erken kilometre taşları, 1978'de bir Ti plazmitinin haritalanmasını ve 1981'de farklı Ti plazmitleri arasındaki dizi benzerliğinin incelenmesini içerir.

1980-2000 yılları arasında, T-DNA bölgesinin ve 'vir' bölgesinin karakterizasyonu da takip edildi. T-DNA bölgesi üzerinde yapılan çalışmalar, onların transfer sürecini belirledi ve bitki hormonlarının ve görüşlerinin sentezine izin veren genleri belirledi. Ayrı olarak, erken çalışma, 'vir' bölgesinde kodlanan genlerin işlevlerini belirlemeyi amaçladı - bunlar, genel olarak bakteri-konak etkileşimlerine izin verenler ve T-DNA iletimini sağlayanlar olarak kategorize edildi.

Çoğaltma, bölümleme ve bakım

RepABC geni kendi gen ürününün ve aktiviteler şematik Agrobacteria'nın Ti plazmid kaset,

Ti plazmitinin replikasyonu, bölünmesi ve bakımı , esas olarak üç genden oluşan repABC gen kasetine bağlıdır : repA , repB ve repC . repA ve repB'nin her biri, plazmit bölümlemesinde yer alan proteinleri kodlarken , repC bir replikasyon başlatıcısını kodlar. Bu genler repA'nın yukarı akışında bulunan 4 farklı promotörden eksprese edilir . repE için küçük kodlar antisens RNA ve arasında yer alan repB ve repC . Buna ek olarak, bir bölme sitesi vardır ( PARS ) ve replikasyon orijini ( oriV içinde) mevcut repABC kaseti.

Ti plazmitinin replikasyonu

Ti plazmitinin replikasyonu, iki protein alanına sahip olan RepC başlatıcı protein ( P05684 ) tarafından yürütülür : DNA'ya bağlanan bir N-terminal alanı (NTD) ve bir C-terminal alanı (CTD). Mutasyon analizleri, fonksiyonel bir RepC proteini olmadan Ti plazmitinin replike olamayacağını göstermiştir. Bu arada, oriV dizisi yaklaşık 150 nükleotid uzunluğundadır ve repC geninde bulunur. Laboratuvar deneyleri, RepC proteininin bu bölgeye bağlandığını ve bunun replikasyonun kaynağı olarak rolünü öne sürdüğünü göstermiştir. Bu nedenle, Ti plazmidinin replikasyonunun arkasındaki tam süreç tam olarak tarif edilmemiş olsa da, replikasyonun ilk adımı muhtemelen RepC'nin ekspresyonuna ve bunun oriV'ye bağlanmasına bağlı olacaktır . Dikkat çekici bir şekilde, RepC proteinin, sadece hareket cis sadece bakteri hücresinde bu kodlanmış plazmid olup herhangi bir başka plasmid de mevcut replikasyonunu sürücüler.

Ti plazmidinin bölünmesi

Bölümleme sistemi Ti plazmidi olan başka plazmidleri ve bakteriyel kromozom kullanılan para / Parb sistemine benzerdir ve aynı şekilde etki ettiği düşünülmektedir. RepA veya RepB proteinlerinden herhangi birinde meydana gelen mutasyonlar, plazmit stabilitesinde bir azalma ile sonuçlanmıştır, bu da bunların plazmit bölünmesindeki rollerini ve önemini gösterir. RepA'nın filamentler oluşturma yeteneği, DNA'nın bölünen bir hücrenin zıt kutuplarına çekilebileceği fiziksel bir köprü oluşturmasını sağlar. Bu arada, RepB proteini, RepA tarafından tanınabilen DNA ile bir kompleks oluşturarak parS dizisine spesifik olarak bağlanabilir . Plazmit bakteri hücresinde sadece birkaç kopya sayısında mevcut olduğundan, bu sistem Ti plazmidinin uygun şekilde bölünmesi için özellikle önemlidir.

Ti plazmidinin bakımı

Ti plazmidi, bir bakteri hücresi içinde düşük kopya sayılarında tutulur. Bu kısmen, çoğaltma başlatıcısı RepC'nin ifadesini etkileyerek elde edilir. Bağlı olduğunda ADP , rEPA negatif olarak hareket RepB ile çalışmak için etkinleştirilir düzenleyici bölgesinin repABC kaseti. Bu nedenle, RepC seviyeleri bir hücre içinde düşük tutulur ve her hücre bölünme döngüsü sırasında çok fazla replikasyon turunun oluşmasını önler. Ayrıca, repE arasında kodlanan olarak bilinen bir RNA vardır repB ve repC ekspresyonunu azaltır repC . RepE, RepC'yi tamamlayıcıdır ve çift ​​sarmallı bir molekül oluşturmak için repC mRNA ile bağlanacaktır . Bu daha sonra RepC proteininin translasyonel üretimini bloke edebilir .

Ayrı olarak, repABC kasetinin ifadesi ve dolayısıyla Ti plazmidinin kopya sayısı da Agrobacterium'daki bir çekirdek algılama sistemi aracılığıyla etkilenir . Çekirdek algılama sistemleri, bakteri hücreleri tarafından düşük seviyelerde üretilen ve yüksek yoğunlukta bakteri mevcut olduğunda bir eşik düzeyine ulaşacak olan, otoindükleyici olarak bilinen bir molekülü algılayarak bakteri popülasyon yoğunluklarına yanıt verir. Bu durumda, otoendüktör N-3-oksooktanoil-L-homoserin lakton (3-OC ₈ TraR olarak bilinen bir regülatör tarafından algılanan AHL) molekül. Aktive edildiğinde, TraR ekspresyonu sağlamak için repABC gen kasetinin promotör bölgelerindeki tra kutuları olarak bilinen bölgelere bağlanacaktır . Bu nedenle, yüksek düzeyde bir popülasyon yoğunluğu, her bir bakteri hücresinde bulunan plazmitlerin sayısını artırır, bu da bitki konakçısında patogenezi desteklemesi muhtemeldir.

Özellikleri

virülans operonu

Oktopin tipi Ti plazmitlerinin vir bölgesinin bileşimi

Vir bölgesinin ekspresyonu genellikle normal koşullar altında bastırılır ve yalnızca bakteri yara bölgelerinden bitki kaynaklı sinyalleri algıladığında aktive olur. Bu aktivasyon, Vir proteinlerinin üretimi ve DNA ile proteinlerin konukçu bitki hücrelerine transferi için gereklidir.

VirA ve VirG, Agrobacterium içinde iki bileşenli bir düzenleyici sistem oluşturur . Bu, bakterilerde yaygın olarak bulunan bir tür algılama ve sinyalizasyon sistemidir; bu durumda, vir bölgesinin ifadesini yönlendirmek için bitki kaynaklı sinyalleri algılamak üzere hareket ederler . Algılama sırasında, bir histidin sensör kinaz olan VirA, bu fosfat grubunu yanıt düzenleyici VirG'ye geçmeden önce fosforile olacaktır . Aktive yanıt düzenleyici VirG daha sonra vir bölgesinin ekspresyonunu aktive etmek için her vir promotörünün yukarı akışında yer alan vir kutusu olarak bilinen bir DNA bölgesine bağlanabilir . VirA ve VirG'nin aracılık ettiği algılamanın olası bir aşağı akış işlevi , bakterilerin bitki kaynaklı sinyallere doğru yönlü hareketi veya kemotaksidir ; bu, Agrobacterium'un bitkilerde yara bölgesine doğru hareket etmesine izin verir . Ayrıca, vir bölgesinin uyarılmasıyla, T-DNA transferine Vir proteinleri aracılık edebilir.

VirB operonu büyük operonu olan Vir (aşağıdaki transfer cihazı bakınız) ana bitki hücreleri, T-DNA ve bakteriyel proteinler aktarma işleminde yer alan 11 virB proteinleri için kodlayan bölge.

VirC VirC1 ve VirC2: iki protein için operon kodlar. Bu proteinler, Agrobacterium'un farklı bitki konakçılarına karşı patogenezini etkiler ve mutasyonlar bakterilerin virülansını azaltabilir ancak ortadan kaldıramaz. Hem virC hem de virD operonları, Ros olarak bilinen kromozomal olarak kodlanmış bir protein tarafından bastırılabilir. Ros, VirG regülatörünün bağlanma bölgesi ile örtüşen ve bu nedenle ekspresyon seviyelerini kontrol etmek için VirG ile rekabet eden bir DNA bölgesine bağlanır. İşlevsel olarak VirC1 ve VirC2 , T-DNA'nın bakterilerden konakçı bitki hücresine konjugatif transferi sırasında bir gevşetici kompleksin birleşmesini destekler . Bu, NTPaz aktivitelerinin aracılık ettiği enerjiye bağlı bir süreçtir ve aşırı hız olarak bilinen bir DNA bölgesine bağlandıklarında meydana gelir . Sonuç olarak, üretilen T-DNA ipliklerinin miktarını artırmak için hareket ederler. Transfer edilecek DNA zincirinin (transfer zinciri, T-ipliği) üretilmesinin ardından VirC proteinleri, transfer zincirinin transfer aparatına yönlendirilmesine de yardımcı olabilir.

Vird VirD1-D4: 4 proteinler için operon kodlar. VirD1 ve VirD2, T-sarmalını üretmek için konjugasyon sırasında T-DNA'nın işlenmesinde yer alır; bu, konakçı bitki hücresine taşınan tek iplikli DNA molekülüdür (aşağıdaki transfer aparatına bakınız). İşlem sırasında VirD1 , DNA zincirlerini çözmek için bir topoizomeraz görevi görecektir . Bir gevşetici olan VirD2 , daha sonra DNA ipliklerinden birini kesecek ve alıcı hücreye aktarılırken DNA'ya bağlı kalacaktır. Alıcı hücre içinde, VirD2 ayrıca aktarılan DNA'yı alıcı hücrenin çekirdeğine yönlendirmek için VirE2 ile birlikte çalışacaktır. VirD2'nin farklı proteinler tarafından fosforillenip defosforile edilebileceği ve bunun DNA verme yeteneğini etkilediği yönünde öneriler var. Tersine, VirD3 hakkında çok az şey bilinmektedir ve mutasyonel analizler, Agrobacterium'un virülansındaki rolü için herhangi bir destek sağlamamıştır . Son olarak, VirD4, konjugasyon sürecinin önemli bir parçasıdır ve T-sarmalını tanıyan ve taşıma kanalına aktaran bir bağlantı faktörü olarak hizmet eder.

VIRE'de VirE1 ve virE2: 2 proteinler için operon kodlar. VirE2, T-şeritiyle birlikte konukçu bitki hücrelerine yer değiştiren bir efektör proteindir. Orada, dağıtımını konukçu bitki hücresinin çekirdeğine yönlendirmek için T ipliğine bağlanır . Bu aktivitenin bir kısmı , protein içinde, çekirdeğe giriş için proteini ve ilişkili DNA'yı işaretleyen nükleer lokalizasyon dizilerinin varlığını içerir . Ayrıca T zincirini nükleaz saldırısından korur . VirE2'nin, DNA'nın bitki sitoplazmik zarından geçmesine izin veren bir protein kanalı olarak rolüyle ilgili bazı spekülasyonlar vardır . Öte yandan, VirE1, VirE2 proteininin konakçı bitki hücresine transferini teşvik etmede rol oynayabilir. VirE2'nin ssDNA bağlama alanına bağlanır, bu nedenle VirE2 proteininin bakteri hücresi içindeki T-şeritine zamanından önce bağlanmasını önler.

virF , tüm Ti plazmit türlerinde olmasa da bazılarında bulunan bir konak özgüllük faktörüdür; örneğin, oktopin tipi Ti plazmitleri virF'ye sahiptir, ancak nopalin tipleri yoktur. A. tumefaciens'in bazı bitki türlerinde taç gal tümörlerini indükleme yeteneği, ancak diğerlerinde değil, bu virF geninin varlığına veya yokluğuna bağlanmıştır .

VirH VirH1 ve VirH2: 2 proteinler için operon kodlar. Bir biyoinformatik VirH proteininin amino asit sekanslarının hastalara çalışma ve bir üst-ailesi olarak bilinen bir protein arasındaki benzerlikleri göstermektedir sitokrom P450 enzimleri. VirH2'nin daha sonra VirA tarafından tespit edilen belirli fenolik bileşikleri metabolize ettiği keşfedildi.

DNA Aktarımı (T-DNA)

Agrobacterium'un T-DNA'sının uzunluğu yaklaşık 15-20 kbp'dir ve rekombinasyon olarak bilinen bir süreç yoluyla transferi üzerine konakçı bitki genomuna entegre olacaktır . Bu işlem , T-DNA'nın bitki genomuna kalıcı olarak eklemlendiği DNA ligasyonu sürecini başlatarak , T-DNA'nın genomdaki kısa dizilerle eşleşmesini sağlamak için konukçu bitki hücresinin genomunda önceden var olan boşlukları kullanır . T-DNA bölgesi, her iki uçta 24bp dizileri ile çevrilidir.

Konak bitki hücresinin genomu içinde, Agrobacterium'un T-DNA'sı, üretilen iki ana protein grubu için eksprese edilir. Bitki büyüme hormonlarının üretiminden bir grup sorumludur. Bu hormonlar üretildikçe hücre bölünme hızında bir artış ve dolayısıyla taç safra tümörlerinin oluşumu olacaktır. İkinci grup proteinler, konakçı bitki hücrelerinde opinlerin sentezini yürütmekten sorumludur. Üretilen spesifik görüşler, bitki konakçısına değil, Ti plazmidinin tipine bağlıdır. Bu görüşler bitki konakçısı tarafından kullanılamaz ve bunun yerine Agrobacterium hücreleri tarafından alınabileceği bitki hücresinden dışarı aktarılacaktır . Bakteriler, Ti plazmidinin diğer bölgelerinde, opinlerin katabolizmasına izin veren genlere sahiptir.

Transfer aparatı

Ti plazmiti içinde kodlanan transfer aparatlarının iki amacı gerçekleştirmesi gerekir: Ti plazmitinin bakteriler arasında konjugatif transferine izin vermek ve T-DNA'nın ve belirli efektör proteinlerin konakçı bitki hücrelerine verilmesine izin vermek. Bunlar, tip IV salgılama sisteminin (T4SS) üyeleri olan sırasıyla Tra/Trb sistemi ve VirB/VirD4 sistemi tarafından sağlanır .

Ti plazmiti ve T-DNA'nın konjugasyon yoluyla transfer edilebilmesi için öncelikle gevşeme enzimi (TraA/VirD2) ve DNA transfer ve replikasyon (Dtr) proteinleri gibi farklı proteinler tarafından işlenmeleri gerekir. Birlikte, bu proteinler , gevşetici kompleksi oluşturmak için Ti plazmidinde transferin orijini ( oriT ) olarak bilinen bir bölgeyi tanıyacak ve ona bağlanacaktır . T-DNA için, T-DNA'nın sınır dizisinde bir çentik oluşturulacak ve çentikli T-ipliği, transfer mekanizmasının geri kalanının bulunduğu hücre zarına taşınacaktır.

VirB/VirD4 sistemi içinde, VirD2 gevşemesine, DNA substratını işlerken VirD1, VirC1 ve VirC2 aksesuar faktörleri yardımcı olur. Ayrıca VirD2 gevşetici ve VirC proteinleri, DNA zincirinin hücre zarındaki VirD4 reseptörüne iletilmesine katkıda bulunacaktır. Bu reseptör, T4SS'lerin temel bir bileşenidir ve enerji verdiği ve DNA'nın iki hücre arasındaki translokasyon kanalına transferine aracılık ettiği düşünülmektedir. Aşağıdaki tablo , VirB/VirD4 sisteminin translokasyon kanalını oluşturan virB operonunda kodlanan proteinleri özetlemektedir .

Biyomühendislikte kullanır

Agrobacterium'un DNA'yı bitki hücrelerine teslim etme yeteneği, bitki genom mühendisliği için yeni kapılar açarak genetiği değiştirilmiş bitkilerin (transgenik bitkiler) üretilmesine izin verdi . T-DNA transferine aracılık eden proteinler, önce T-DNA bölgesinin sınır dizilerini tanıyacaktır. Bu nedenle, bilim adamlarının istenen herhangi bir ilgi dizisini kuşatmak için T-DNA sınır dizilerini kullanmaları mümkündür - böyle bir ürün daha sonra bir plazmide eklenebilir ve Agrobacterium hücrelerine yerleştirilebilir. Orada, sınır dizileri A. tumefaciens'in transfer cihazı tarafından tanınacak ve standart bir şekilde hedef bitki hücresine teslim edilecektir. Ayrıca, sadece T-DNA'nın sınır dizilerini geride bırakarak, ortaya çıkan ürün, bitkilerde herhangi bir tümöre neden olmadan bitki genomunu düzenleyecektir. Bu yöntem, pirinç, arpa ve buğday dahil olmak üzere çeşitli mahsul bitkilerini değiştirmek için kullanılmıştır. Daha sonraki çalışmalar, A. tumefaciens'in hedeflerini mantarları ve insan hücre dizilerini içerecek şekilde genişletti .

Ayrıca bakınız

• Mary-Dell Chilton
• Jeff Schell
• Marc Van Montagu

Referanslar

Dış bağlantılar

• Agrobacterium tumefaciens plazmidi pTi-SAKURA, tam dizi
• Ti Plazmit Genetik Haritası
• taç safra hastalığı