Tatil kavşağı - Holliday junction
.svg)
Bir Holliday bağlantısı bir dallı, nükleik asit , dört çift sarmallı kol araya içeren yapısı. Bu kollar, çeşitli biri olarak seçilmiştir konformasyon bağlı olarak tampon tuz konsantrasyonları ve dizisi ve nükleobaz birleşme en yakın kattır. Yapı almıştır Robin Holliday , moleküler biyolog 1964 varlığını önerilmiştir.
Biyolojide, Holliday kavşakları, birçok genetik rekombinasyon tipinde ve ayrıca çift zincirli kopma onarımında anahtar bir ara maddedir . Bu bağlantılar genellikle simetrik bir diziye sahiptir ve bu nedenle hareketlidir, yani dört ayrı kol, baz eşleşmesini büyük ölçüde koruyan belirli bir modelde bağlantı boyunca kayabilir . Ek olarak, bazı fonksiyonel RNA moleküllerinde Holliday bağlantılarına benzer dört kollu bağlantılar görülür .
Telleri belirli bir pozisyonda kilitleyen asimetrik dizilere sahip hareketsiz Holliday kavşakları, doğal Holliday kavşakları için bir model olarak yapılarını incelemek için bilim adamları tarafından yapay olarak yaratıldı. Bu kavşaklar daha sonra DNA nanoteknolojisinde temel yapısal yapı taşları olarak kullanım buldu ; burada çoklu Holliday kavşakları, moleküllere yüksek derecede yapısal sertlik sağlayan özel tasarlanmış geometrilerde birleştirilebilir .
Yapı
Holliday bağlantıları , dört çift sarmal kol arasında farklı koaksiyel istifleme modellerine sahip çeşitli konformasyonel izomerlerde bulunabilir . Koaksiyel istifleme, nükleik asit kör uçlarının maruz kalan bazlar arasındaki etkileşimler yoluyla birbirine bağlanma eğilimidir . Üç olası konformer vardır: yığılmamış (veya açık-X) form ve iki yığılmış form. İstiflenmemiş form , ipliklerin negatif yüklü omurgaları arasındaki elektrostatik itme nedeniyle Mg2 + gibi iki değerlikli katyonların yokluğunda baskındır . En az yaklaşık 0.1 m M Mg2 + varlığında , elektrostatik itme karşılanır ve istiflenmiş yapılar baskındır. 2000 yılı itibariyle, elektrostatik korumanın, katyonların birleşme yerine bölgeye özgü bağlanmasının sonucu olup olmadığı veya çözeltideki iyonların dağınık bir koleksiyonunun mevcudiyeti kesin olarak bilinmiyordu.
İstiflenmemiş form, neredeyse kare düzlemsel, genişletilmiş bir konformasyondur. Öte yandan, istiflenmiş konformerler, sağ el yönünde yaklaşık 60°'lik bir açıyla ayrılmış iki sürekli çift sarmal alana sahiptir . Dört şeritten ikisi, iki çift sarmal alanın her birinin içinde kalan, kabaca sarmal olarak kalırken, diğer ikisi iki alan arasında antiparalel bir şekilde çaprazlanır .
İki olası yığılmış form, kol çiftlerinin birbiriyle istiflendiği durumlarda farklılık gösterir; ikisinden hangisinin baskın olduğu, bağlantıya en yakın baz dizilerine büyük ölçüde bağlıdır. Bazı diziler, iki konformer arasında bir denge ile sonuçlanırken, diğerleri güçlü bir şekilde tek bir konformeri tercih eder. Özellikle, bağlantı noktasını köprüleyen A-CC dizisini içeren bağlantıların, bağlantı noktasında ikinci sitozin ile fosfatlardan biri arasında bir hidrojen bağının oluşmasına izin veren konformeri şiddetle tercih ettiği görülmektedir. Çoğu çalışma, her bir koldaki birleşme noktasına en yakın dört bazın kimliklerine odaklanmış olsa da, daha uzaktaki bazların da gözlenen istiflenme biçimlerini etkileyebileceği açıktır.
Simetrik dizili kavşaklarda, dallanma noktası hareketlidir ve rastgele bir yürüyüş sürecinde göç edebilir . Dal göç hızı iyon konsantrasyonu ile çarpıcı biçimde değişir, tek adımlı süreler iyonsuz 0,3-0,4 ms'den 10 mM Mg2 + ile 270−300 ms'ye yükselir . Hızdaki değişim, istiflenmiş yapılara karşı istiflenmemiş yapıların oluşumu ile ilişkilidir.
Bağlantı noktasında bir çentik veya tellerden birinde kopma olan Holliday kavşakları, dikey bir yönelimi benimser ve her zaman çentiği sarmal bir şerit yerine bir çapraz şerit üzerine yerleştiren istifleme konformerini tercih eder.
RNA Holliday bağlantıları, yüksek magnezyum konsantrasyonlarında antiparalel yığılmış bir konformasyon, orta konsantrasyonlarda dik bir yığılmış konformasyon varsayar ve düşük konsantrasyonlarda paralel bir yığılmış konformasyona dönerken, küçük kalsiyum iyonu konsantrasyonları bile antiparalel konformeri destekler.
biyolojik fonksiyon
Holliday kavşağı, genleri iki kromozom arasında kaydırarak genetik çeşitliliği artıran biyolojik bir süreç olan homolog rekombinasyonda ve ayrıca integrazları içeren bölgeye özgü rekombinasyon olaylarında anahtar bir ara maddedir . Ayrıca çift zincir kırıklarının onarımında da görev alırlar . Ek olarak, DNA süper bobinlerinde simetrik dizilerdeki sarmal gerilimi azaltmak için Holliday bağlantılarını içeren haç biçimli yapılar ortaya çıkabilir . Dört kollu birleşme aynı zamanda görünür da fonksiyonel RNA gibi moleküller, U1 spliceosomal RNA ve saç tokası ribozimi ve tütün halka-benekli virüs , bu genellikle çok sıkı Holliday yapısını kabul değildir, böylece eşleştirilmiş çift sarmal alanları arasında çiftlenmemiş nükleotidleri içerir ve .
Homolog rekombinasyondaki Holliday bağlantıları, merkezi bağlantı etrafında simetrik bir dizi düzenlemesine yol açan aynı veya neredeyse aynı diziler arasındadır. Bu , tellerin birleşme noktasından geçtiği yerde bir dal geçiş sürecinin gerçekleşmesine izin verir . Holliday kavşağının bölünmesi veya çözülmesi iki şekilde meydana gelebilir. Orijinal iplik setinin bölünmesi, gen dönüşümü gösterebilen ancak kromozomal çaprazlama göstermeyen iki moleküle yol açarken, diğer iki iplik setinin bölünmesi, ortaya çıkan rekombinant moleküllerin çapraz geçiş göstermesine neden olur. Bölünmeden bağımsız olarak tüm ürünler, Holliday bağlantı göçü bölgesinde heteroduplekslerdir .
Birçok protein, Holliday bağlantı yapısını tanıyabilir veya bozabilir. Böyle bir sınıf , bazen diziye özgü bir tarzda, bağlantıları parçalayan bağlantı çözücü enzimler içerir . Bu tür proteinler, bağlantının yapısını çeşitli şekillerde bozar, çoğu zaman bağlantıyı istiflenmemiş bir konformasyona çeker, merkezi baz çiftlerini kırar ve/veya dört kol arasındaki açıları değiştirir. Diğer sınıflar, döviz kurunu büyüklük sıralarına göre artıran dal göç proteinleri ve bölgeye özgü rekombinazlardır . Prokaryotlarda, Holliday bağlantı çözülmeleri, dizileri korunmasa da her biri yapısal olarak benzer olan integrazlar ve nükleazlar olmak üzere iki aileye ayrılır.
Ökaryotlarda, homolog rekombinasyonun DNA'daki çift zincir kırıklarını nasıl onardığına ilişkin iki ana model, çift zincirli kırılma onarımı (DSBR) yolu (bazen çift Holliday bağlantı modeli olarak adlandırılır ) ve senteze bağlı zincir tavlama (SDSA) yoludur. Çift iplik kırılması durumunda, 3' ucu bozulur ve daha uzun olan 5' ucu bitişik kardeş kromatidi istila ederek bir replikasyon balonu oluşturur. Bu kabarcık kırık DNA'ya yaklaştıkça, daha uzun olan 5' antisens zinciri, ikinci bir kopyayı kopyalayarak DNA'nın bu bölümünün duyu zincirini yeniden işgal eder. Çoğaltma sona erdiğinde, her iki kuyruk da iki Holliday Kavşağı oluşturmak üzere yeniden bağlanır ve bunlar daha sonra proteinler tarafından çeşitli modellerde bölünür. Bu işlemin bir animasyonu burada görülebilir .
Bakterilerdeki çift zincirli DNA kırıkları , homolog rekombinasyonun RecBCD yolu ile onarılır . Tek zincirli boşluklar olarak bilinen iki DNA zincirinden sadece birinde meydana gelen kırılmaların RecF yolu ile onarıldığı düşünülmektedir . Hem RecBCD hem de RecF yolakları, dal göçü olarak bilinen , tek DNA ipliklerinin iki çaprazlanmış dupleks DNA molekülü arasında değiş tokuş edildiği bir dizi reaksiyonu ve bu iki çaprazlanmış DNA molekülünün kesilip normale döndürüldüğü çözünürlük içerir. çift sarmal hali. Homolog rekombinasyon birkaç virüs grubunda meydana gelir . Olarak , DNA virüsleri gibi herpesvirüsü , rekombinasyon bakteri ve ökaryotlarda gibi bir ara-ve-yeniden katılma mekanizma aracılığıyla gerçekleşir. Bakterilerde dal göçü , bağlantıyı hareket ettirmek için ATP hidrolizinin enerjisini kullanan moleküler motorlar olan RuvABC kompleksi veya RecG proteini tarafından kolaylaştırılır . Bağlantı daha sonra iki ayrı dupleks halinde çözülmeli, ya ebeveyn konfigürasyonu ya da çapraz konfigürasyon geri yüklenmelidir. Çözünürlük, homolog rekombinasyon sırasında yatay veya dikey bir şekilde meydana gelebilir ve yama ürünleri (çift iplik kopma onarımı sırasında aynı yönelimdeyse) veya ekleme ürünleri (çift iplik kopma onarımı sırasında farklı yönlerdeyse) verebilir. RuvA ve RuvB, dal göç proteinleridir, RuvC ise bağlantı çözücü bir enzimdir.
Bazı RNA virüslerinde , özellikle retrovirüsler , picornavirüsler ve koronavirüsler gibi pozitif anlamda ssRNA virüslerinde rekombinasyon olduğuna dair kanıtlar vardır . Homolog rekombinasyonun influenza gibi negatif anlamda ssRNA virüslerinde oluşup oluşmadığı konusunda tartışmalar vardır .
Çözünürlük
Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae'de , Holliday kavşakları, esas olarak in vivo tüm Holliday bağlantı çözünürlüğünü hesaba katan dört farklı yolla çözülebilir . Çoğunluğu üreten yolu geçitler de S. cerevisiae maya tomurcuklanma, ve muhtemelen, memelilerde, proteinler içerir EXO1 , MLH1 - MLH3 heterodimer (denilen MutL y) ve SGS1 (arasında ortologu Bloom sendromu helikaz ). MLH1-MLH3 heterodimer tercihen Holliday bağlantılarına bağlanır. Süper sarmallı çift sarmallı DNA'da tek zincirli kırılmalar yapan bir endonükleazdır. MLH1-MLH3 heterodimer, çapraz rekombinantların oluşumunu destekler . Sırasıyla MUS81 -MMS4, SLX1 ve YEN1 proteinlerini içeren diğer üç yol, in vivo Holliday bağlantı çözünürlüğünü destekleyebilirken , üç nükleazın hepsinin yokluğu, çapraz ürünlerin oluşumu üzerinde yalnızca mütevazı bir etkiye sahiptir.
Hem MLH3 (ana yol) hem de MMS4 (minör yol) için silinen çift mutantlar, vahşi tipe kıyasla (6 ila 17 kat); bununla birlikte spor canlılığı oldukça yüksekti (%62) ve kromozomal ayrılma çoğunlukla işlevsel görünüyordu.
MUS81, protozoan Tetrahymena thermophila'da tomurcuklanan maya, bitkiler ve omurgalıların mayoz bölünmesinde küçük bir çapraz yolun bir bileşeni olmasına rağmen , MUS81, baskın çapraz yolun değilse de önemli bir parçası gibi görünmektedir. MUS81 yolu ayrıca fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe'de baskın çapraz geçiş yolu gibi görünmektedir .
MSH4 ve MSH5 proteinler, maya ve insanlarda bir hetero-oligomerik yapı (heterodimeri) oluşturur. Mayada Saccharomyces cerevisiae MSH4 ve MSH5, mayoz sırasında homolog kromozomlar arasındaki geçişleri kolaylaştırmak için spesifik olarak hareket eder. MSH4/MSH5 kompleksi, çift Holliday bağlantılarını bağlar ve stabilize eder ve bunların çapraz ürünlere dönüşmesini sağlar. S. cerevisiae'nin bir MSH4 hipomorfik (kısmen işlevsel) mutantı, çaprazlama sayılarında genom çapında %30'luk bir azalma ve değişmeyen kromozomlu çok sayıda mayoz gösterdi. Bununla birlikte, bu mutant, değişmeyen kromozomların ayrılmasının verimli bir şekilde gerçekleştiğini öne süren spor canlılık modellerine yol açtı. Bu nedenle S. cerevisiae'de uygun ayrım görünüşe göre tamamen homolog çiftler arasındaki geçişlere bağlı değildir.
DNA nanoteknolojisinde kullanım
DNA nanoteknolojisi, canlı hücrelerde genetik bilginin taşıyıcıları olarak değil , nanoteknoloji için mühendislik malzemeleri olarak yapay nükleik asit yapılarının tasarımı ve üretimidir . Alan, daha karmaşık, rasyonel olarak tasarlanmış yapılar oluşturmak için temel bileşenler olarak dallı DNA yapılarını kullanır. Holliday bağlantıları bu nedenle bu tür birçok DNA yapısının bileşenleridir. İzole edilmiş Holliday bağlantı kompleksleri, büyük sıralı diziler halinde bir araya getirilemeyecek kadar esnek olduğundan, daha sonra daha büyük "diziler" halinde birleştirilebilen sert " karolar " oluşturmak için çoklu Holliday bağlantılarına sahip yapısal motifler kullanılır .
Bu tür en yaygın motif, birbirine çok yakın iki Holliday kavşağı içeren çift çaprazlama (DX) kompleksidir ve bu, daha büyük diziler halinde kendi kendine birleşebilen katı bir yapı ile sonuçlanır. DX molekülünün yapısı, Holliday bağlantılarını, tercih ettikleri yaklaşık 60° açının aksine, çift sarmal alanlarla doğrudan yan yana olan bir yapıyı benimsemeye zorlar. Kompleks, bağlantıları paralel veya antiparalel bir yönelime zorlamak için tasarlanabilir, ancak pratikte antiparalel çeşitlilik daha iyi davranışlıdır ve paralel versiyon nadiren kullanılır.
DX yapısal motifi, daha büyük iki ve üç boyutlu yapıları rastgele şekillerde yapmak için kullanılan DNA origami yönteminin temel yapı taşıdır . Tek tek DX karoları kullanmak yerine, tek bir uzun iskele teli, birkaç kısa ştapel şeridi ile istenen şekle katlanır. Birleştirildiğinde, iskele ipliği çift sarmal alanlar boyunca süreklidir, zımba telleri Holliday bağlantılarına çapraz şeritler olarak katılır.
Holliday kavşağının doğal 60° açısını koruyan bazı karo türleri gösterilmiştir. Böyle bir dizi, bir paralelkenar düzenlemesinde dört Holliday bağlantısı içeren karoları kullanır. Bu yapı, bağlantı açısının atomik kuvvet mikroskobu ile doğrudan görselleştirilmesine izin verme avantajına sahipti . Üç Holliday bağlantısının karoları, biyomoleküllerin X-ışını kristalografisinde kullanılmak üzere periyodik üç boyutlu diziler yapmak için üçgen bir tarzda kullanılmıştır . Bu yapılar, elemanları hem çekme hem de basınçta kullanan gerginlik ilkesine dayanan yapısal birimlere benzerliklerinden dolayı adlandırılır .
Tarih
Robin Holliday , 1964'te Ustilago maydis ve Saccharomyces cerevisiae organizmaları üzerine yaptığı araştırmaya dayanarak, şimdi kendi adını taşıyan bağlantı yapısını, homolog rekombinasyon modelinin bir parçası olarak önerdi . Her iki yönde açıklanan bir molekül bir mekanizma sağlamıştır gen dönüşümü ve kromozomal geçit . Holliday, önerilen yolun, tek bir genin farklı versiyonları arasında baz uyumsuzlukları olan heterodubleks DNA segmentleri yaratacağını fark etti . Hücrenin, daha sonra keşfedilen uyumsuzluk onarımı için bir mekanizmaya sahip olacağını tahmin etti. Holliday'in modelinden önce, kabul edilen model , yeni zincirin doğrudan farklı ana dizilerin parçalarından sentezlendiği bir kopya-seçim mekanizması içeriyordu .
Homolog rekombinasyon için orijinal Holliday modelinde, her ebeveyn DNA'sının bir zincirinde aynı noktada tek iplikli kopmalar meydana gelir. Her kırık ipliğin serbest uçları daha sonra diğer DNA sarmalına geçer. Orada, istilacı teller karşılaştıkları serbest uçlara birleştirilir ve Holliday kavşağı ile sonuçlanır. Her çaprazlama dizisi orijinal partner dizisine yeniden tavlanırken, önündeki orijinal tamamlayıcı ipliğin yerini alır. Bu, Holliday kavşağının göç etmesine ve heterodubleks segmentleri oluşturmasına neden olur. Hangi ipliğin diğerini onarmak için bir şablon olarak kullanıldığına bağlı olarak, mayoz bölünmeden kaynaklanan dört hücre , her birinin normal ikisi yerine, bir allelin üç kopyası ve diğerinden sadece biri ile sonuçlanabilir, bu özellik gen dönüşümü olarak bilinir. .
Holliday'in orijinal modeli, heterodubleks DNA'nın her iki kromozomda da bulunacağını varsayıyordu, ancak maya üzerindeki deneysel veriler bunu çürütüyordu. 1975 yılında Matt Meselson ve Charley Radding tarafından güncellenen bir model , şube göçü fikrini ortaya attı. 1980'lerdeki diğer gözlemler, çift zincirli kırılma modeli ( Jack Szostak , Frank Stahl ve diğerleri tarafından) ve tek zincirli tavlama modeli gibi rekombinasyon için alternatif mekanizmaların önerisine yol açtı . Üçüncüsü, senteze bağlı iplik tavlama modeli, Holliday bağlantılarını içermiyordu.
Holliday kavşağının yapısı için ilk deneysel kanıt, 1970'lerin sonlarında, dört kollu yapının plazmit ve bakteriyofaj DNA görüntülerinde açıkça görülebildiği elektron mikroskobu çalışmalarından geldi . Daha sonra 1980'lerde, Holliday bağlantılarının oluşumunu başlatmaktan ve bunlara bağlanmaktan sorumlu enzimler tanımlandı, ancak 2004 itibariyle memeli Holliday bağlantı çözümlerinin tanımlanması zor kaldı (ancak, daha fazlası için yukarıdaki "Holiday bağlantılarının çözünürlüğü" bölümüne bakın). son bilgiler). 1983 yılında yapay Holliday bağlantı molekülleri ilk olarak Nadrian Seeman tarafından sentetik oligonükleotitlerden inşa edildi ve fiziksel özelliklerinin daha doğrudan incelenmesine izin verildi. Holliday bağlantı yapısının erken analizinin çoğu, jel elektroforezi , FRET ve hidroksil radikali ve nükleaz ayak izi çalışmalarından çıkarılmıştır. 1990'larda, kristalografi ve nükleik asit NMR yöntemlerinin yanı sıra hesaplamalı moleküler modelleme araçları da kullanılabilir hale geldi .
Başlangıçta, genetikçiler birleşmenin antiparalel değil paralel bir yapıyı benimseyeceğini varsaydılar , çünkü bu homolog dupleksleri birbirine daha yakın hizaya sokacaktı. 1980'lerdeki kimyasal analizler, birleşme yerinin aslında tartışmalı olarak kabul edilen bir bulgu olan antiparalel konformasyonu tercih ettiğini gösterdi ve Robin Holliday başlangıçta bulgulardan şüphe etti. Antiparalel yapı daha sonra in vitro moleküller üzerindeki X-ışını kristalografi verileri nedeniyle yaygın olarak kabul edildi , ancak 2004 itibariyle in vivo yapı için çıkarımlar belirsiz kaldı, özellikle bağlantıların yapısı genellikle ona bağlı proteinler tarafından değiştirilir.
DNA nanoteknolojisinin kavramsal temeli ilk olarak 1980'lerin başında Nadrian Seeman tarafından ortaya atılmıştır . O zamanlar, DNA replikasyon çatalı ve mobil Holliday bağlantısı dahil olmak üzere bir dizi doğal dallı DNA yapısı biliniyordu , ancak Seeman'ın görüşü, birleştirilmiş moleküldeki simetriyi ortadan kaldırmak için iplik dizilerini uygun şekilde tasarlayarak hareketsiz nükleik asit bağlantılarının oluşturulabileceğiydi. ve bu hareketsiz bağlantıların prensipte katı kristal kafesler halinde birleştirilebileceği. Bu şemayı öneren ilk teorik makale 1982'de yayınlandı ve bir hareketsiz DNA bağlantısının ilk deneysel gösterimi ertesi yıl yayınlandı. Seeman , 1998'de kendisi ve Erik Winfree tarafından gösterilen, iki boyutlu kafesler oluşturmaya uygun , daha katı çift çapraz (DX) motifini geliştirdi . 2006'da Paul Rothemund , rastgele şekildeki katlanmış DNA yapılarını kolayca ve sağlam bir şekilde oluşturmak için DNA origami tekniğini ilk kez gösterdi . Bu yöntem, daha önce mümkün olandan çok daha büyük ve teknik olarak tasarlamak ve sentezlemek için daha az çaba gerektiren yapıların yaratılmasına izin verdi. Üç boyutlu bir kafesin sentezi, sonunda Seeman tarafından 2009'da, bunu başarmak için yola çıktıktan yaklaşık otuz yıl sonra yayınlandı.
Referanslar
Dış bağlantılar
- ABD Ulusal Tıp Kütüphanesi'ndeki Holliday+kavşakları Tıbbi Konu Başlıkları (MeSH)
- Holliday Kavşağının Konformasyonel Değişimi
- Sentetik DNA substratları (bir protokol) kullanılarak proteinlerin dal göç aktivitelerinin analizi