DNA sentezi - DNA synthesis
DNA sentezi , deoksiribonükleik asit (DNA) moleküllerinin doğal veya yapay olarak oluşturulmasıdır . DNA, tekrar eden bir yapıda kovalent bağlar ve hidrojen bağları ile birbirine bağlanan nükleotit birimlerinden oluşan bir makromoleküldür . DNA sentezi, bu nükleotid birimleri DNA'yı oluşturmak üzere bir araya geldiklerinde meydana gelir; bu yapay olarak ( in vitro ) veya doğal olarak ( in vivo ) oluşabilir . Nükleotid birimleri azotlu bir baz (sitozin, guanin, adenin veya timin), pentoz şeker (deoksiriboz) ve fosfat grubundan oluşur. Her birim, fosfat grubu ile bir sonraki nükleotidin pentoz şekeri arasında bir şeker-fosfat omurgası oluşturan bir kovalent bağ oluştuğunda birleştirilir. Spesifik baz eşleşmesi (adenin ve timin, guanin ve sitozin), nükleotit bazları arasında hidrojen bağları oluştuğunda doğal olarak meydana geldiğinden, DNA tamamlayıcı, çift sarmallı bir yapıdır.
DNA sentezi için birkaç farklı tanım vardır: DNA replikasyonu - DNA biyosentezi ( in vivo DNA amplifikasyonu ), polimeraz zincir reaksiyonu - enzimatik DNA sentezi ( in vitro DNA amplifikasyonu ) veya gen sentezi - fiziksel olarak yapay gen dizileri oluşturma . Her sentez türü çok farklı olsa da, bazı özellikleri paylaşırlar. Polinükleotitleri oluşturmak üzere birleştirilen nükleotitler, bir DNA sentezi formunun - PCR - meydana gelmesi için bir DNA şablonu görevi görebilir. DNA replikasyonu aynı zamanda bir DNA şablonu kullanarak da çalışır, DNA çift sarmalı replikasyon sırasında gevşer, yeni nükleotidler için eşleşmemiş bazları hidrojen bağına maruz bırakır. Bununla birlikte, gen sentezi bir DNA şablonu gerektirmez ve genler de novo olarak birleştirilir .
DNA sentezi tüm ökaryotlarda ve prokaryotlarda ve ayrıca bazı virüslerde gerçekleşir . DNA'daki mutasyonlardan kaçınmak için DNA'nın doğru sentezi önemlidir. İnsanlarda, mutasyonlar kanser gibi hastalıklara yol açabilir, bu nedenle DNA sentezi ve in vivo dahil olan makineler , on yıllar boyunca kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Gelecekte bu çalışmalar, veri depolamada kullanılacak DNA sentezini içeren teknolojilerin geliştirilmesinde kullanılabilir.
DNA kopyalama
Doğada, DNA molekülleri, DNA replikasyonu süreci boyunca tüm canlı hücreler tarafından sentezlenir. Bu tipik olarak hücre bölünmesinin bir parçası olarak ortaya çıkar. DNA replikasyonu gerçekleşir, böylece hücre bölünmesi sırasında her yavru hücre, hücrenin genetik materyalinin doğru bir kopyasını içerir. İn vivo DNA sentezi (DNA replikasyonu), hücre döngüsünün S fazı sırasında uyumlu bir şekilde hareket etmek üzere evrimleşmiş olan bir dizi karmaşık enzime bağlıdır . Hem ökaryotlarda hem de prokaryotlarda, spesifik topoizomerazlar, helikazlar ve girazlar (kopyalama başlatıcı proteinler) çift sarmallı DNA'yı açarak azotlu bazları açığa çıkardığında DNA replikasyonu meydana gelir . Bu enzimler, yardımcı proteinlerle birlikte, DNA dizilerinin doğru bir şekilde kopyalanmasını sağlayan bir makromoleküler makine oluşturur. Yeni bir çift sarmallı DNA molekülü oluşturan tamamlayıcı baz eşleşmesi gerçekleşir. Yeni DNA molekülünün bir ipliği 'ana' iplikten olduğu için bu yarı korunumlu replikasyon olarak bilinir .
Sürekli olarak ökaryotik enzimler, DNA replikasyonunu bozabilecek DNA hasarıyla karşılaşırlar. Bu hasar, kendiliğinden veya DNA'ya zarar veren ajanlara bağlı olarak ortaya çıkan DNA lezyonları şeklindedir. Bu nedenle DNA replikasyon makineleri, hasarla karşılaşıldığında çökmeyi önlemek için yüksek düzeyde kontrol edilir. DNA replikasyon sisteminin kontrolü, genomun her döngüde sadece bir kez replike olmasını sağlar; aşırı replikasyon DNA hasarına neden olur. DNA replikasyonunun deregülasyonu, kanser gelişimi sırasında genomik kararsızlıkta önemli bir faktördür.
Bu , in vivo DNA sentez makinelerinin özgüllüğünü vurgular . Doğal olarak oluşan DNA'nın replikasyonunu yapay olarak uyarmak veya yapay gen dizileri oluşturmak için çeşitli araçlar mevcuttur. Bununla birlikte, in vitro DNA sentezi çok hataya açık bir süreç olabilir.
DNA onarım sentezi
Hasarlı DNA , her bir işlemin belirli hasar türlerini onarmak için özelleştiği birkaç farklı enzimatik onarım işlemiyle onarılabilir. İnsanların DNA'sı birçok doğal kaynaktan zarar görebilir ve yetersiz onarım, hastalık ve erken yaşlanma ile ilişkilidir . Çoğu DNA onarım süreci, onarımın bir ara aşaması sırasında DNA'da tek zincirli boşluklar oluşturur ve bu boşluklar onarım sentezi ile doldurulur. DNA sentezi ile boşluk doldurmayı gerektiren spesifik onarım süreçleri, nükleotid eksizyon onarımı , baz eksizyon onarımı , uyumsuzluk onarımı , homolog rekombinasyon onarımı, homolog olmayan uç birleştirme ve mikrohomoloji aracılı uç birleştirmeyi içerir .
Ters Transkripsiyon
Ters transkripsiyon, retrovirüsler de dahil olmak üzere belirli virüs ailelerinin replikasyon döngüsünün bir parçasıdır . Ters transkriptaz enzimleri kullanılarak RNA'nın çift sarmallı tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) kopyalanmasını içerir . Retrovirüslerde viral RNA, bir konak hücre çekirdeğine yerleştirilir. Orada, bir viral ters transkriptaz enzimi, RNA dizisine DNA nükleotidleri ekleyerek , viral proteinleri kodlayan enzim integrazı tarafından konakçı hücre genomuna eklenen cDNA'yı üretir .
Polimeraz zincirleme reaksiyonu
Bir polimeraz zincir reaksiyonu , DNA'nın erimesi ve DNA'nın enzimatik replikasyonu için reaksiyonun tekrarlanan ısıtma ve soğutma döngülerini kullanarak laboratuvarda bir enzimatik DNA sentezi şeklidir .
PCR sırasında DNA sentezi, canlı hücrelere çok benzer, ancak çok spesifik reaktiflere ve koşullara sahiptir. PCR sırasında DNA, konakçı şaperon proteinlerinden kimyasal olarak ekstrakte edilir ve daha sonra ısıtılarak DNA ipliklerinin termal ayrışmasına neden olur. Orijinal diziden iki yeni cDNA dizisi oluşturulur, bu diziler başka PCR ürünleri için şablon görevi görmek üzere tekrar bölünebilir. Orijinal DNA, birçok PCR turu ile çoğaltılır. Orijinal DNA zincirinin bir milyardan fazla kopyası yapılabilir.
rastgele mutajenez
Yapısal ve evrimsel çalışmalar gibi birçok deney için, bilim adamlarının belirli bir DNA dizisinin geniş bir varyantları kitaplığı oluşturması gerekir. Rastgele mutajenez, in vitro olarak, düşük kaliteli DNA polimeraz ile mutajenik replikasyon, mutant DNA'nın birçok kopyasını üretmek için seçici PCR amplifikasyonu ile birleştirildiğinde gerçekleşir.
RT-PCR
RT-PCR, cDNA'yı şablon DNA'dan ziyade mRNA'dan sentezlediği için geleneksel PCR'den farklıdır. Teknik, bir RNA dizisi, enzim, ters transkriptaz için bir şablon görevi gördüğünden, PCR tabanlı amplifikasyon ile bir ters transkripsiyon reaksiyonunu birleştirir. RT-PCR genellikle çeşitli gelişim aşamalarında belirli doku veya hücre tiplerinde gen ekspresyonunu test etmek veya genetik bozuklukları test etmek için kullanılır.
gen sentezi
Yapay gen sentezi , ilk şablon DNA örneklerine ihtiyaç duymadan bir genin in vitro sentezlenmesi işlemidir . 2010 yılında J. Craig Venter ve ekibi, Mycoplasma laboratuvarı olarak adlandırılan kendi kendini kopyalayan bir mikrop oluşturmak için tamamen sentezlenmiş DNA'yı kullanan ilk kişilerdi .
Oligonükleotid sentezi
Oligonükleotid sentezi , nükleik asit dizilerinin kimyasal sentezidir. Biyolojik araştırma ve biyomühendisliğin çoğunluğu, oligonükleotidleri , sentetik genleri ve hatta kromozomları içerebilen sentetik DNA'yı içerir . Bugün, tüm sentetik DNA, Marvin H. Caruthers tarafından fosforamidit yöntemi kullanılarak özel olarak oluşturulmuştur . Oligolar, doğal temelleri kopyalayan yapı taşlarından sentezlenir. İşlem 1970'lerin sonlarından beri otomatikleştirilmiştir ve istenen genetik dizileri oluşturmak için olduğu kadar tıp ve moleküler biyolojideki diğer kullanımlar için de kullanılabilir. Bununla birlikte, dizileri kimyasal olarak oluşturmak 200-300 bazın ötesinde pratik değildir ve çevreye zararlı bir işlemdir. Yaklaşık 200 bazdan oluşan bu oligolar, daha büyük DNA molekülleri oluşturarak DNA birleştirme yöntemleri kullanılarak bağlanabilir.
Bazı çalışmalar, şablon gerektirmeyen bir DNA polimerazı olan terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) kullanılarak enzimatik sentez olasılığını araştırmıştır . Ancak bu yöntem henüz kimyasal sentez kadar etkili değildir ve ticari olarak mevcut değildir.
Yapay DNA sentezindeki gelişmelerle birlikte, DNA veri depolama olasılığı araştırılmaktadır. Ultra yüksek depolama yoğunluğu ve uzun vadeli kararlılığı ile sentetik DNA, büyük miktarda veri depolamak için ilginç bir seçenektir. Yeni nesil dizileme teknolojileri aracılığıyla DNA'dan çok hızlı bir şekilde bilgi alınabilmesine rağmen, DNA'nın de novo sentezi bu süreçte önemli bir darboğazdır. Her döngüde yalnızca bir nükleotid eklenebilir ve her döngü saniyeler sürer, bu nedenle genel sentez çok zaman alıcıdır ve hataya çok açıktır. Ancak biyoteknoloji gelişirse, bir gün veri depolamada sentetik DNA kullanılabilir.
Baz çifti sentezi
AT ( adenin - timin ) ve GC'nin ( guanin - sitozin ) yanı sıra yeni nükleobaz çiftlerinin de sentezlenebildiği bildirilmiştir . Sentetik nükleotitler, genetik alfabeyi genişletmek ve DNA bölgelerinin spesifik modifikasyonuna izin vermek için kullanılabilir. Sadece üçüncü bir baz çifti bile, mevcut 20 amino asitten DNA tarafından kodlanabilen amino asitlerin sayısını olası 172'ye çıkarır. Hachimoji DNA'sı , dört olası baz çifti oluşturan sekiz nükleotit harfinden oluşur. Bu nedenle, doğal DNA'nın bilgi yoğunluğunun iki katıdır. Çalışmalarda, RNA, hachimoji DNA'sından bile üretilmiştir. Bu teknoloji, DNA'da veri depolamaya izin vermek için de kullanılabilir.