Aminoalil nükleotid - Aminoallyl nucleotide

Aminoalil üridin (aa-UTP)

Aminoalil nükleotid , bir allilamin içeren modifiye edilmiş bir baza sahip bir nükleotiddir . Bu post-etiketleme olarak kullanılan nükleik asitler ile floresans algılama değerinin mikrodizi . N-Hidroksisüksinimid ester grubu ile reaktiftirler , bu da nükleotid üzerindeki birincil amino grubuna floresan bir boya eklenmesine yardımcı olur . Bu nükleotidler 5- (3-amino allil ) -nükleotidler olarak bilinirler çünkü aminoalil grubu genellikle urasil veya sitozinin pirimidin halkasının karbon 5'ine bağlıdır . Aminoalil kısımdaki birincil amin grubu alifatiktir ve dolayısıyla doğrudan bazların halkalarına ( aromatik ) bağlanan amin gruplarına kıyasla daha reaktiftir . Aminoalil nükleositlerin genel isimleri, aminoalili belirtmek için başlangıçta aa veya AA- ile kısaltılır. 5-karbonlu şeker, dahil edildiğinde deoksiribozu veya yoksa ribozu belirten küçük harf "d" ile veya olmadan gösterilir . Son olarak, azotlu baz ve fosfat sayısı belirtilir (yani aa-UTP = aminoalil üridin trifosfat ).

Tarih

Aa-dUTP'ler kullanılarak hiyerarşik olarak kümelenmiş ısı haritası

Floresans ve nükleik asitleri birleştirmenin amacı, DNA veya RNA üzerinde çalışmak için tespit edilebilen izotopik olmayan bir etiket sağlamaktır . Bu tür etiketleme, bilim adamlarının DNA veya RNA'yı yapıları, işlevleri veya diğer nükleik asitlerle oluşum açısından incelemelerine olanak tanır. Floresan etiketleme için ilk temel modifikasyon, 1971'de 4-tiyoüridin ve 4- tiyoürasil ile meydana geldi . Bu araştırma, diğerleriyle birlikte, çeşitli doğrudan ve doğrudan olmayan etiketleme türlerini içeren: analoglar , enzimler yoluyla ekleme veya nükleotidlerin etiketlenmesini bilim adamlarının DNA'yı incelemesi için çok daha güvenli hale getirdi.

Enstrümantasyon ve teknolojiler, DNA mikrodizisi alanında daha gelişmiş hale geldikçe , daha ileri bilimsel çalışmalar için daha iyi reaktifler ve teknikler gerekecektir. Cy3 ile floresan etiketlemenin daha yetersiz ve çarpık sonuçlar olduğu gösterildi; bunun yerine aminoalil nükleotid birleştirme yöntemi tercih edildi. Dolaylı floresan etiketleme olarak aminoalil nükleotitlerin kullanılması, siyanin etiketlemede görülen hassasiyet sorunlarını ortadan kaldırıyor gibi görünüyordu .

Sentez

Aminoalil nükleositler , aşağıdaki görüntüde gösterildiği gibi Heck bağlanması yoluyla sentezlenebilir .

Heck birleştirme aminoalil nükleotid reaksiyonu

Yukarıdaki görüntüde, solda, pirimidin halkasındaki beşinci karbonda bir iyot (iyot elektrofilik halojenleme yoluyla eklenir ) ile modifiye edilmiş bir nükleosit bulunmaktadır . Oluşumu, bir alilamin ile bir reaksiyonla ilişkilendirilebilir ve halojen birleştirme yoluyla çeşitli reaktifler, halojen grubunu bazdan çıkarabilir ve sağda gösterilen aminoalil nükleosit haline gelmek için allilamini ekleyebilir. Sağdaki ürün daha sonra RNA sentezinde moleküler biyolojide kullanılır .

Diğer reaksiyonlar, diğer halojenlerle tek bir kap sentezini içerir .

Reaksiyon

Aminoalil nükleotid üzerindeki birincil amin, siyanin gibi amino-reaktif boyalarla ve süksinimidil ester ( NHS ) gibi reaktif bir ayrılan grup içeren patentli boyalarla reaksiyona girer. Bazın halkasına doğrudan bağlı amin grupları etkilenmez. . Bu nükleotidler, DNA'yı etiketlemek için kullanılır.

Değiştirilmiş uridinin etiketlenmesi

Kullanımlar

Aminoalil NTP'ler, PCR , nick çevirisi , primer uzantıları ve cDNA sentezinde dolaylı DNA etiketlemesi için kullanılır . Bu etiketli NTP'ler, radyoaktif materyali işleme kapasitesine sahip olmadıkları moleküler biyoloji laboratuvarlarındaki uygulamaları nedeniyle faydalıdır. Örneğin, 5- (3-Aminoalil) -Üridin (AA-UTP'ler), DNA'nın yüksek yoğunluklu etiketlenmesi için DNA'yı önceden etiketlemekten daha etkilidir. NTP'lerin enzimatik eklenmesinden sonra, DNA molekülünün saptanması için amin reaktan floresan boyalar eklenebilir. DNA / RNA polimeraz tarafından DNA veya RNA moleküllerine eklendiğinde, 5- (3-aminoalil) -UTP, diğer kimyasal grupların eklenmesi için reaktif bir grup sağlar. Bu nedenle, aminoalil ile modifiye edilmiş DNA veya RNA, bir amin-reaktif gruba sahip herhangi bir bileşik ile etiketlenebilir. Bir ikincil boya birleştirme reaktifleri ile kombinasyon halinde DNA / RNA'ya dahil edilen aa-NTP'ler, bir dizi analizi için prob yapabilir.

cDNA, saptama amaçları için aminoalil etiketlemeye dayanır. DNTP'nin doğrudan etiketlenmesi, floresan etiketlemenin en hızlı ve en ucuz yöntemi olmasına rağmen, sekans kullanım için sadece bir modifiye nükleotide izin verdiği için dezavantajlıdır. Doğrudan etiketlemenin başka bir dezavantajı, hacimli nükleotidlerdir, ancak bu, aminoalil ile modifiye edilmiş nükleotidler kullanılarak dolaylı etiketleme ile aşılabilir. Etiketleme başarısını kontrol etmenin kolay bir yolu renktir; İyi etiketleme, nihai malzemede görünür mavi (Cy5) veya kırmızı (Cy3) renkle sonuçlanacaktır.

Amino-alil etiketli cDNA hazırlama işlemi

Aminoallyl etiketleme kullandığı bir diğer işlemdir NASBA (Nükleik Asit Sekans bazlı amplifikasyon), RNA yı çoğaltmak için son derece hassas bir tekniktir. Bu özel durumda, aaUTP ile değiştirilmiş RNA'lar, floresan pazarı Cy3 ile etiketlendi. Aminoalil-UTP etiketleme ile birleştirilmiş NASBA, çevresel izleme, biyolojik tehdit algılama, endüstriyel proses izleme ve klinik mikrobiyoloji dahil olmak üzere birçok farklı mikrobiyal teşhis alanı için çok yararlıdır. DNA mikrodizisi, özellikle AA-NTP'lerin DNA mikrodizi testini daha hızlı ve ucuza yapmasını kullanan başka bir yöntemdir.

Sentez sonrası etiketleme, eşit etiketleme etkinliğine sahip problar üreterek, Cy etiketli dNTP'lerin doğrudan enzimatik birleşiminde bulunan problemleri önler. Dolaylı etiketleme ile aminle modifiye edilmiş NTP'ler, ters transkripsiyon , RNA amplifikasyonu veya PCR sırasında dahil edilir . Amino allil-NTP'ler, polimerizasyon sırasında modifiye edilmemiş NTP'ler ile benzer verimlilikle birleştirilir.

Etiketleme ile ilgili endişeler: Aminalil ile modifiye edilmiş nükleotiddeki amin grubu, siyanin serisi veya diğer patentli boyalar gibi boyalarla reaktiftir. Boyalar , nükleotitlerin uygun şekilde depolanması için gerekli olan tamponlama maddeleriyle reaksiyona girdiğinde bir problem ortaya çıkar . Bununla birlikte, bu sorunun üstesinden gelmek için bir karbonat tamponu kullanılabilir.

Ayrıca bakınız

Referanslar

  1. ^ Hogan, Daniel J .; Riordan, Daniel P .; Gerber, André P .; Herschlag, Daniel; Brown, Patrick O. (2008). "Çeşitli RNA Bağlayıcı Proteinler, Kapsamlı Bir Düzenleyici Sistem Önererek İşlevsel Olarak İlişkili RNA Setleriyle Etkileşir" . PLOS Biyolojisi . 6 (10): e255. doi : 10.1371 / journal.pbio.0060255 . PMC   2573929 . PMID   18959479 .
  2. ^ a b Kricka, LJ; Fortina, P (Nisan 2009). "Analitik soy: nükleositlerin, nükleotitlerin ve nükleik asitlerin floresan etiketlemesinde" ilkler " . Klinik Kimya . 55 (4): 670–83. doi : 10.1373 / Clinchem.2008.116152 . PMID   19233914 .
  3. ^ Secrist III, John A .; Jorge R. Barrio; Nelson J. Leonard (3 Aralık 1971). "4-tiyoürasil ve 4-tiyoüridine bir floresan etiketin yapıştırılması". Biyokimyasal ve Biyofiziksel Araştırma İletişimi . 45 (5): 1262–1270. doi : 10.1016 / 0006-291x (71) 90154-9 . PMID   4332594 .
  4. ^ a b c Farrell, Robert (2010-07-22). RNA Metodolojileri: İzolasyon ve Karakterizasyon için Laboratuvar Kılavuzu . s. 597. ISBN   9780080454764 .
  5. ^ a b Reddington, Mark; Danielunninghan-Bryant (12 Ocak 2011). "(E) -5-aminoalil-2p-deoksisitidin ve bazı ilgili türevlerin uygun sentezi". Tetrahedron Mektupları . 52 (2): 181-183. doi : 10.1016 / j.tetlet.2010.10.137 .
  6. ^ a b c Biyosistemler, Uygulandı. "Modifiye Nükleotid 5- (3-aminoalil) -UTP" (PDF) .
  7. ^ a b Biyoteknoloji, Trilink. "Değiştirilmiş Nükleotidler" (PDF) .
  8. ^ Kore, Anılkumar R .; Bo Yang; Balasubramanian Srinivasan (13 Kasım 2013). "(E) -5- [3-Aminoalil] -uridin-5p-trifosfatın flüor destekli sentezi". Tetrahedron Mektupları . 54 (46): 6264–6266. doi : 10.1016 / j.tetlet.2013.09.026 .
  9. ^ DeRisi, Joseph. "Amino-alil Boya Birleştirme Protokolü" (PDF) . Erişim tarihi: 9 Nisan 2014 .
  10. ^ a b AnaSpec, Inc. "Hiyte Flor Broşürü" (PDF) . 13 Nisan 2014 tarihinde orjinalinden (PDF) arşivlendi . Erişim tarihi: 9 Nisan 2014 .
  11. ^ a b yaşam teknolojileri. "Aminoalil dUTP" . Alındı 24 Mart 2014 .
  12. ^ a b Xiang, CC; Kozhich, OA; Chen, M; Inman, JM; Phan, QN; Chen, Y; Brownstein, MJ (Temmuz 2002). "DNA mikrodizileri için probları etiketlemek için aminle modifiye edilmiş rastgele primerler". Doğa Biyoteknolojisi . 20 (7): 738–42. doi : 10.1038 / nb0702-738 . PMID   12089562 .
  13. ^ Gibriel, Abdullah (17 Nisan 2012). "DNA mikro dizi tabanlı tespit yöntemlerinde nükleik asit örneklerini etiketlemek için seçenekler mevcuttur" . Fonksiyonel Genomikte Brifingler . II (4): 311–318. doi : 10.1093 / bfgp / els015 . PMID   22510454 .
  14. ^ Yeşil, Michael. "Moleküler Klonlama-Bir Laboratuvar Kılavuzu" . Cold Spring Harbor Laboratuvar Basın.
  15. ^ Ott, Scheler; Barry Glynn (2009). "Mikroarray uygulamaları için NASBA ile güçlendirilmiş tmRNA moleküllerinin floresan etiketlemesi". BMC Biyoteknoloji .
  16. ^ 't Hoen, PA; de Kort, F; van Ommen, GJ; den Dunnen, JT (1 Mart 2003). "Mikroarray uygulamaları için cRNA'nın floresan etiketlenmesi" . Nükleik Asitler Araştırması . 31 (5): e20. doi : 10.1093 / nar / gng020 . PMC   149842 . PMID   12595569 .
  17. ^ Kaposi-Novak, P; Lee, JS; Mikaelyan, A; Patel, V; Thorgeirsson, SS (Ekim 2004). "Lineer RNA amplifikasyonundan aminoalil etiketli cDNA hedeflerinin oligonükleotit mikro-dizi analizi" . BioTechniques . 37 (4): 580, 582–6, 588. doi : 10.2144 / 04374ST02 . PMID   15517970 .
  18. ^ Sesli, P; Wheeler, C .; Latham, H. (2001). "CyScribe Post-Labeling Kit ile amino alil yöntemini kullanarak mikrodizi hibridizasyonu için oldukça floresan, eşit şekilde etiketlenmiş problar hazırlama". Yaşam Bilimleri Haberleri . 9 : 17–19.

Dış bağlantılar

  • Holly Bennet ve Joe DeRisi'nin örnek protokolü , Chris Seidel tarafından modifiye edilen Rosetta Bilişim'den alınmıştır.
  1. ^ Seidel, Chris. "Floresan Prob Hazırlama" . Alındı 24 Mart 2014 .