X-ışını kristalografisi - X-ray crystallography

X-ışını kristalografisi ( XRC ) bir atomik ve moleküler yapısını belirlemek deneysel bilimdir kristal kristal yapısının gelen bir ışın sebep olan, X-ışınları için yaymak çok özel yöne. Bu kırınımlı ışınların açılarını ve yoğunluklarını ölçerek, bir kristalograf , kristal içindeki elektron yoğunluğunun üç boyutlu bir resmini üretebilir . Bu elektron yoğunluğundan , kristaldeki atomların ortalama konumları, kimyasal bağları , kristalografik bozuklukları ve diğer çeşitli bilgiler belirlenebilir.

Tuzlar , metaller , mineraller , yarı iletkenler ve ayrıca çeşitli inorganik, organik ve biyolojik moleküller gibi birçok malzeme kristaller oluşturabildiğinden , X-ışını kristalografisi birçok bilimsel alanın gelişiminde temel olmuştur. İlk on yıllık kullanımında, bu yöntem atomların boyutunu, kimyasal bağların uzunluklarını ve türlerini ve çeşitli malzemeler, özellikle mineraller ve alaşımlar arasındaki atomik ölçek farklılıklarını belirledi . Yöntem ayrıca vitaminler , ilaçlar, proteinler ve DNA gibi nükleik asitler de dahil olmak üzere birçok biyolojik molekülün yapısını ve işlevini ortaya çıkardı . X-ışını kristalografisi, yeni malzemelerin atomik yapısını karakterize etmek ve diğer deneylerle benzer görünen malzemeleri ayırt etmek için hala birincil yöntemdir . X-ışını kristal yapıları ayrıca bir malzemenin olağandışı elektronik veya elastik özelliklerini açıklayabilir, kimyasal etkileşimlere ve işlemlere ışık tutabilir veya hastalıklara karşı farmasötiklerin tasarlanmasında temel olarak hizmet edebilir .

Tek kristalli bir X-ışını kırınım ölçümünde, bir gonyometreye bir kristal monte edilir . Gonyometre, kristali seçilen yönlerde konumlandırmak için kullanılır. Kristal, ince odaklanmış monokromatik bir X-ışınları ışını ile aydınlatılır ve yansımalar olarak bilinen düzenli aralıklı noktalardan oluşan bir kırınım deseni üretir . Farklı yönlerde alınan iki boyutlu görüntüler , örnek için bilinen kimyasal verilerle birleştirilmiş Fourier dönüşümlerinin matematiksel yöntemi kullanılarak kristal içindeki elektron yoğunluğunun üç boyutlu bir modeline dönüştürülür . Kristaller çok küçükse veya iç yapılarında yeterince üniform değilse, zayıf çözünürlük (bulanıklık) ve hatta hatalar ortaya çıkabilir.

X-ışını kristalografisi, atomik yapıların belirlenmesine yönelik diğer birkaç yöntemle ilişkilidir. Benzer kırınım desenleri, saçılan elektronlar veya nötronlar tarafından üretilebilir ve bunlar benzer şekilde Fourier dönüşümü ile yorumlanır . Yeterli boyutta tek kristaller elde edilemezse, daha az ayrıntılı bilgi elde etmek için çeşitli diğer X-ışını yöntemleri uygulanabilir; bu tür yöntemler arasında fiber kırınımı , toz kırınımı ve (numune kristalize değilse) küçük açılı X-ışını saçılımı (SAXS) bulunur. İncelenen malzeme yalnızca nanokristalin tozlar biçiminde mevcutsa veya zayıf kristalliğe sahipse, atom yapısını belirlemek için elektron kristalografisi yöntemleri uygulanabilir.

Yukarıda bahsedilen tüm X-ışını kırınım yöntemleri için saçılma elastiktir ; saçılan X-ışınları , gelen X-ışını ile aynı dalga boyuna sahiptir . Buna karşılık, esnek olmayan X-ışını saçılması yöntemleri, örneğin atomlarının dağılımından ziyade plazmonlar , kristal alan ve yörünge uyarıları, magnonlar ve fononlar gibi numunenin uyarımlarının incelenmesinde faydalıdır .

Tarih

Kristallerin ve X-ışınlarının erken bilimsel tarihi

Kepler'in Strena seu de Nive Sexangula adlı çalışmasından kare (Şekil A, yukarıda) ve altıgen (Şekil B, aşağıda) ambalaj çizimi .

Kristaller, düzenlilikleri ve simetrileri nedeniyle uzun zamandır hayranlık uyandırıyor olsalar da, 17. yüzyıla kadar bilimsel olarak araştırılmamıştı. Johannes Kepler , Strena seu de Nive Sexangula (Yeni Yıl Altıgen Kar Hediyesi) (1611) adlı çalışmasında, kar tanesi kristallerinin altıgen simetrisinin , küresel su parçacıklarının düzenli bir şekilde paketlenmesinden kaynaklandığını varsaymıştı .

X-ışını kristalografisi ile gösterildiği gibi, kar tanelerinin altıgen simetrisi, her bir su molekülü etrafındaki hidrojen bağlarının tetrahedral düzenlenmesinden kaynaklanır . Su molekülleri, benzer şekilde düzenlenir silikon atomlarının tridimit polimorf SiO 2 . Bir ana eksen boyunca bakıldığında ortaya çıkan kristal yapı altıgen simetriye sahiptir.

Danimarkalı bilim adamı Nicolas Steno (1669) kristal simetrinin deneysel araştırmalarına öncülük etti. Steno, belirli bir kristal tipinin her örneğinde yüzler arasındaki açıların aynı olduğunu gösterdi ve René Just Haüy (1784), bir kristalin her yüzünün aynı şekil ve büyüklükteki blokların basit istifleme desenleriyle tanımlanabileceğini keşfetti. . Bu nedenle, 1839'da William Hallowes Miller , her yüze üç küçük tamsayıdan oluşan benzersiz bir etiket verebildi, Miller indeksleri bugün kristal yüzleri tanımlamak için kullanılmaya devam ediyor. Haüy'ün çalışması, kristallerin atom ve moleküllerin düzenli bir üç boyutlu dizisi (bir Bravais kafesi ) olduğu doğru fikrine yol açtı ; tek bir birim hücre , mutlaka dik olması gerekmeyen üç ana yön boyunca süresiz olarak tekrarlanır. 19. yüzyılda, bir kristalin olası simetrilerinin eksiksiz bir kataloğu Johan Hessel , Auguste Bravais , Evgraf Fedorov , Arthur Schönflies ve (gecikmeli olarak) William Barlow (1894) tarafından çalışıldı . Mevcut verilerden ve fiziksel akıl yürütmeden yola çıkarak, Barlow 1880'lerde daha sonra X-ışını kristalografisi ile doğrulanan birkaç kristal yapı önerdi; ancak, 1880'lerde eldeki veriler, onun modellerini kesin olarak kabul etmek için çok azdı.

X-ışını kristalografisi , katıyı bir arada tutan hidrojen bağlarını (1) ortaya çıkararak buzdaki su moleküllerinin düzenini gösterir . Maddenin yapısını bu kadar hassas ( çözünürlük ) başka birkaç yöntem belirleyebilir .

Wilhelm Röntgen, X-ışınlarını 1895'te tam kristal simetri çalışmaları tamamlanmak üzereyken keşfetti. Fizikçiler X-ışınlarının doğasından emin değillerdi, ancak kısa süre sonra bunların bir ışık biçimi olan elektromanyetik radyasyon dalgaları olduklarından şüphelendiler . Maxwell teorisi elektromanyetik radyasyon de bilim adamları arasında kabul edildi, ve ile deneyler Charles Glover Barkla röntgenler de dahil olmak üzere, enine elektromanyetik dalgalar ile bağlantılı olayları arzettiğini ve daha sonra kutuplaşma ve spektral çizgileri görülür dalga boylarına gözlenenlere benzer. Arnold Sommerfeld'in laboratuvarındaki tek yarık deneyleri , X-ışınlarının dalga boyunun yaklaşık 1 angstrom olduğunu öne sürdü . X-ışınları sadece dalgalar değil, aynı zamanda fotonlardır ve parçacık özelliklerine sahiptirler. Albert Einstein foton kavramını 1905'te tanıttı, ancak Arthur Compton'un elektronlardan X-ışınlarının saçılmasıyla doğruladığı 1922'ye kadar geniş çapta kabul görmedi . Gazların iyonlaşması gibi X-ışınlarının parçacık benzeri özellikleri, William Henry Bragg'i 1907'de X-ışınlarının elektromanyetik radyasyon olmadığını tartışmaya sevk etmişti . Bragg'in görüşünün popüler olmadığı kanıtlandı ve 1912'de Max von Laue tarafından X-ışını kırınımı gözlemi, çoğu bilim adamı için X-ışınlarının bir elektromanyetik radyasyon şekli olduğunu doğruladı.

X-ışını difraksiyon

Gelen ışın (sol üstten gelen) her saçıcının yoğunluğunun küçük bir kısmını küresel bir dalga olarak yeniden yaymasına neden olur. Dağıtıcılar d ayrımı ile simetrik olarak düzenlenirse , bu küresel dalgalar sadece yol-uzunluk farkının 2 d sin θ dalga boyunun λ tamsayı katına eşit olduğu yönlerde senkronize olacaktır (yapıcı olarak eklenir) . Bu durumda, gelen ışının bir kısmı 2θ'lik bir açıyla saptırılır , bu da kırınım deseninde bir yansıma noktası oluşturur .

Kristaller düzenli atom dizileridir ve X-ışınları elektromanyetik radyasyon dalgaları olarak kabul edilebilir. Atomlar, öncelikle atomların elektronları aracılığıyla X-ışını dalgalarını saçar. Bir deniz fenerine çarpan bir okyanus dalgasının deniz fenerinden yayılan ikincil dairesel dalgalar üretmesi gibi, bir elektrona çarpan bir X-ışını da elektrondan yayılan ikincil küresel dalgalar üretir. Bu fenomen elastik saçılma olarak bilinir ve elektron (veya deniz feneri) saçıcı olarak bilinir . Düzenli bir saçıcı dizisi, düzenli bir küresel dalga dizisi üretir. Bu dalgalar yıkıcı girişim yoluyla çoğu yönde birbirlerini iptal etseler de , Bragg yasasıyla belirlenen birkaç özel yönde yapıcı bir şekilde eklerler :

Burada d , kırınım düzlemleri arasındaki boşluktur , gelen açıdır, n herhangi bir tam sayıdır ve λ, ışının dalga boyudur. Bu özel yönler, yansıma adı verilen kırınım deseninde noktalar olarak görünür . Böylece, X-ışını kırınımı, düzenli bir saçıcı dizisine (kristal içindeki atomların tekrar eden düzenlemesi) çarpan bir elektromanyetik dalgadan (X-ışını) kaynaklanır.

X-ışınları kırınım desenini üretmek için kullanılır, çünkü dalga boyları λ tipik olarak kristaldeki düzlemler arasındaki boşluk d ile aynı büyüklük mertebesindedir (1-100 angstrom) . Prensipte, düzenli bir saçılım dizisine çarpan herhangi bir dalga , ilk olarak Francesco Maria Grimaldi tarafından 1665'te tahmin edildiği gibi , kırınım üretir . Önemli kırınım üretmek için, saçıcılar arasındaki boşluk ve çarpan dalganın dalga boyu benzer boyutta olmalıdır. Örnek olarak, güneş ışığının bir kuşun tüyünden kırınımı ilk olarak 17. yüzyılın sonlarında James Gregory tarafından rapor edildi . Görünür ışık için ilk yapay kırınım ızgaraları 1787'de David Rittenhouse ve 1821'de Joseph von Fraunhofer tarafından yapılmıştır. Bununla birlikte, görünür ışığın kristallerden kırınımı gözlemlemek için çok uzun bir dalga boyu (tipik olarak 5500 angstrom) vardır. İlk X-ışını kırınım deneylerinden önce, bir kristaldeki kafes düzlemleri arasındaki boşluklar kesin olarak bilinmiyordu.

Kristaller bir şekilde kullanılabileceği fikri kırınım ızgara için X ışınları arasındaki konuşmayı 1912 yılında ortaya çıkan Paul Peter Ewald ve Max von Laue içinde İngiliz Bahçesi'nin de Münih . Ewald, tezi için kristallerin bir rezonatör modeli önermişti, ancak bu model , dalga boyu rezonatörler arasındaki boşluktan çok daha büyük olduğu için görünür ışık kullanılarak doğrulanamadı . Von Laue, bu kadar küçük aralıkları gözlemlemek için daha kısa bir dalga boyuna sahip elektromanyetik radyasyonun gerekli olduğunu fark etti ve X-ışınlarının kristallerdeki birim hücre aralığıyla karşılaştırılabilir bir dalga boyuna sahip olabileceğini öne sürdü. Von Laue, iki teknisyen, Walter Friedrich ve asistanı Paul Knipping ile bir bakır sülfat kristali boyunca bir X-ışınları demeti parlatmak ve bunun kırınımını bir fotoğraf plakasına kaydetmek için çalıştı . Geliştirildikten sonra, plaka, merkezi kiriş tarafından üretilen noktanın etrafında kesişen daireler şeklinde düzenlenmiş çok sayıda iyi tanımlanmış nokta gösterdi. Von Laue, kristaldeki birim hücre aralıklarının saçılma açılarını ve boyutunu ve yönünü birbirine bağlayan bir yasa geliştirdi ve 1914'te Nobel Fizik Ödülü'ne layık görüldü .

Saçılma

Aşağıdaki matematiksel türevde açıklandığı gibi , X-ışını saçılımı, kristal içindeki elektronların yoğunluğu tarafından belirlenir. Bir X-ışınının enerjisi bir değerlik elektronununkinden çok daha büyük olduğu için, saçılma Thomson saçılması , bir elektromanyetik ışının bir serbest elektronla etkileşimi olarak modellenebilir . Bu model genellikle saçılan radyasyonun polarizasyonunu tanımlamak için benimsenmiştir.

Kütlesi m ve temel yükü q olan bir parçacık için Thomson saçılımının şiddeti :

Bu nedenle, bir elektrondan çok daha ağır olan atom çekirdeği saçılan X-ışınlarına ihmal edilebilir düzeyde katkıda bulunur.

1912'den 1920'ye kadar gelişme

Her ne kadar elmas (üst sol) ve grafit (üst sağ) kimyasal olarak özdeş olan hem saf bileşim oluşu C -X-ışını kristalografisi (alt) atomlarının düzeni ortaya farklı özellikler oluşturmaktadır. Elmasta, karbon atomları dörtyüzlü olarak düzenlenir ve tek kovalent bağlarla bir arada tutulur , bu da onu her yönden güçlü kılar. Buna karşılık, grafit yığılmış tabakalardan oluşur. Levha içinde, bağ kovalenttir ve altıgen simetriye sahiptir, ancak levhalar arasında kovalent bağ yoktur, bu da grafitin pullara ayrılmasını kolaylaştırır.

Von Laue'nin öncü araştırmalarından sonra, alan, özellikle fizikçiler William Lawrence Bragg ve babası William Henry Bragg tarafından hızla gelişti . 1912-1913'te, genç Bragg , gözlemlenen saçılmayı kristal içindeki eşit aralıklı düzlemlerden yansımalarla birleştiren Bragg yasasını geliştirdi . Braggs, baba ve oğul, kristalografi alanındaki çalışmaları nedeniyle 1915 Nobel Fizik Ödülü'nü paylaştılar. En eski yapılar genellikle basitti ve tek boyutlu simetri ile işaretlendi. Bununla birlikte, sonraki on yıllarda hesaplamalı ve deneysel yöntemler geliştikçe, birim hücredeki atomların daha karmaşık iki ve üç boyutlu düzenlemeleri için güvenilir atomik konumlar çıkarmak mümkün hale geldi.

X-ışını kristalografisinin moleküllerin ve minerallerin yapısını belirleme potansiyeli - o zamanlar sadece kimyasal ve hidrodinamik deneylerden belli belirsiz biliniyordu - hemen fark edildi. En eski yapılar basit inorganik kristaller ve minerallerdi, ancak bunlar bile fizik ve kimyanın temel yasalarını ortaya çıkardı. 1914'te "çözülecek" (yani belirlenecek) ilk atomik çözünürlük yapısı sofra tuzuydu . Elektronların sofra tuzu yapısındaki dağılımı, kristallerin mutlaka kovalent bağlı moleküllerden oluşmadığını gösterdi ve iyonik bileşiklerin varlığını kanıtladı . Elmasın yapısı aynı yıl çözüldü, kimyasal bağlarının tetrahedral düzenini kanıtladı ve C-C tekli bağının uzunluğunun 1.52 angstrom olduğunu gösterdi. Diğer erken yapılar arasında 1914'te bakır , kalsiyum florür ( florit olarak da bilinen CaF 2 ), kalsit (CaCO 3 ) ve pirit (FeS 2 ); Spinel (mgAl 2 O 4 ) 1915; rutil ve anatas biçimleri titanyum dioksit (TiOz 2 1916'da); pyrochroite Mn (OH) 2 uzatma ve, brusit Mg (OH) 2 aynı zamanda, 1919 yılında 1919 yılında sodyum nitrat (NaNO 3 ) ve sezyum dichloroiodide (CsICl 2 ) ile tespit edilmiştir Ralph Walter Graystone'un Wyckoff ve hekzagonal (altıgen ZnS) yapısı 1920 yılında tanınmaya başlandı.

Grafitin yapısı, 1916'da Peter Debye ve Paul Scherrer ve bağımsız olarak 1917'de Albert Hull tarafından geliştirilen ilgili toz kırınımı yöntemiyle çözüldü . Grafitin yapısı, 1924'te tek kristal kırınımından iki kişi tarafından belirlendi. gruplar bağımsızdır. Hull ayrıca demir ve magnezyum gibi çeşitli metallerin yapılarını belirlemek için toz yöntemini kullandı.

Kültürel ve estetik önem

1951'de Britanya Festivali'ndeki Festival Desen Grubu, insülin , çin kili ve hemoglobinin X-ışını kristalografisine dayalı dantel ve baskılar tasarlamak için işbirlikçi bir tekstil üreticileri ve deneyimli kristalograflar grubuna ev sahipliği yaptı . Projenin önde gelen bilim adamlarından biri, o sırada Cambridge'deki Cavendish Laboratuvarı'nda Araştırma Direktör Yardımcısı olan Dr. Helen Megaw (1907–2002) idi. Megaw, kristal diyagramlardan ilham alan ve tasarımdaki potansiyellerini gören merkezi figürlerden biri olarak kabul ediliyor. 2008'de Londra'daki Wellcome Collection, Festival Pattern Group üzerine "Atomdan Modellere" adlı bir serginin küratörlüğünü yaptı.

Kimya ve malzeme bilimine katkılar

X-ışını kristalografisi, kimyasal bağların ve kovalent olmayan etkileşimlerin daha iyi anlaşılmasına yol açmıştır . İlk çalışmalar atomların tipik yarıçaplarını ortaya çıkardı ve elmas yapısında karbonun tetrahedral bağlanması, amonyum heksakloroplatinatta (IV) gözlenen metallerin oktahedral bağlanması ve gözlenen rezonans gibi birçok teorik kimyasal bağlanma modelini doğruladı. düzlemsel karbonat grubu ve aromatik moleküllerde. Kathleen Lonsdale'in 1928 heksametilbenzen yapısı, benzenin altıgen simetrisini oluşturdu ve alifatik C–C bağları ile aromatik C–C bağları arasında bağ uzunluğunda açık bir fark gösterdi; bu bulgu , kimyanın gelişimi için derin sonuçları olan kimyasal bağlar arasındaki rezonans fikrine yol açtı . Onun vardığı sonuçlar, 1921'de diğer moleküllere dayalı olarak naftalin ve antrasen modellerini yayınlayan William Henry Bragg tarafından öngörülmüştü , bu erken bir moleküler replasman şekliydi .

Yine 1920'lerde, Victor Moritz Goldschmidt ve daha sonra Linus Pauling, kimyasal olarak olası olmayan yapıları ortadan kaldırmak ve atomların göreli boyutlarını belirlemek için kurallar geliştirdiler. Bu kurallar brokit'in (1928) yapısına ve titanyum dioksitin rutil , brokit ve anataz formlarının nispi stabilitesinin anlaşılmasına yol açtı .

Bağlanmış iki atom arasındaki mesafe, bağ kuvvetinin ve bağ düzeninin hassas bir ölçüsüdür ; bu nedenle, X-ışını kristalografik çalışmaları, inorganik kimyada metal-metal çift bağları, metal-metal dörtlü bağları ve üç-merkezli, iki-elektron bağları gibi daha da egzotik bağ türlerinin keşfedilmesine yol açmıştır . X-ışını kristalografisi - ya da daha doğrusu, esnek olmayan bir Compton saçılma deneyi - hidrojen bağlarının kısmen kovalent karakteri için de kanıt sağlamıştır . Organometalik kimya alanında, ferrosenin X-ışını yapısı sandviç bileşiklerin bilimsel çalışmalarını başlatırken , Zeise'nin tuzununki "geri bağlanma" ve metal-pi kompleksleri araştırmalarını teşvik etti. Son olarak, X-ışını kristalografisi, supramoleküler kimyanın gelişmesinde , özellikle taç eterlerin yapılarının ve konukçu-konuk kimyasının ilkelerinin açıklığa kavuşturulmasında öncü bir role sahipti .

X-ışını kırınımı, katalizör geliştirmede çok güçlü bir araçtır . Ex-situ ölçümler, malzemelerin kristal yapısını kontrol etmek veya yeni yapıları çözmek için rutin olarak gerçekleştirilir. Yerinde deneyler, reaksiyon koşulları altında katalizörlerin yapısal kararlılığı hakkında kapsamlı bir anlayış sağlar.

Malzeme bilimlerinde, fullerenler , metaloporfirinler ve diğer karmaşık bileşikler gibi tek kristalli yöntemler kullanılarak birçok karmaşık inorganik ve organometalik sistem analiz edilmiştir . Polimorflarla ilgili son zamanlardaki problemlerden dolayı , farmasötik endüstrisinde de tek kristal kırınım kullanılmaktadır . Tek kristal yapıların kalitesini etkileyen başlıca faktörler, kristalin boyutu ve düzenliliğidir; yeniden kristalleştirme , küçük moleküllü kristallerde bu faktörleri iyileştirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Cambridge Yapısal Veritabanı Haziran 2019 tarihi itibariyle 1.000.000 yapıları içerir; bu yapıların %99'dan fazlası X-ışını kırınımı ile belirlendi.

Mineraloji ve metalurji

Mars toprağının ilk X-ışını kırınım görüntüsü - CheMin analizi feldspat , piroksenler , olivin ve daha fazlasını ortaya koyuyor ( Curiosity gezgini , " Rocknest ", 17 Ekim 2012).

1920'lerden beri, X-ışını kırınımı, mineraller ve metallerdeki atomların düzenini belirlemek için başlıca yöntem olmuştur . X-ışını kristalografi uygulama mineraloji yapısı ile başlayan garnet Menzer 1924 belirlenmiştir. 1920'lerde silikatların sistematik bir X-ışını kristalografik çalışması yapıldı . Bu çalışma, Si / O oranı değiştikçe, silikat kristallerinin atomik düzenlerinde önemli değişiklikler sergilediğini göstermiştir. Machatschki bu görüşleri, alüminyumun silikatların silikon atomlarının yerini aldığı minerallere kadar genişletti . X-ışını kristalografisinin metalurjiye ilk uygulaması da 1920'lerin ortalarında gerçekleşti. En kayda değer olarak, Linus Pauling'in alaşımının 'in yapısı, Mg 2 Sn kompleksi, iyonik kristallerin kararlılık ve yapının teorisine yol açtı.

17 Ekim 2012 tarihinde, Curiosity Rover üzerinde gezegen Mars "da Rocknest " ilk X-ışını kırınım analizi yapıldı Mars toprağı . Gezicinin CheMin analizöründen elde edilen sonuçlar, feldispat , piroksenler ve olivin dahil olmak üzere çeşitli minerallerin varlığını ortaya çıkardı ve numunedeki Mars toprağının Hawaii yanardağlarının "yıpranmış bazaltik topraklarına " benzer olduğunu öne sürdü .

Erken organik ve küçük biyolojik moleküller

1945'te Dorothy Crowfoot Hodgkin tarafından çözülen penisilinin üç boyutlu yapısı. Yeşil, kırmızı, sarı ve mavi küreler sırasıyla karbon , oksijen , kükürt ve azot atomlarını temsil eder . Beyaz küreler , X-ışını analizi yerine matematiksel olarak belirlenen hidrojeni temsil eder .

Organik bir bileşiğin ilk yapısı, heksametilentetramin , 1923'te çözüldü. Bunu, biyolojik zarların önemli bir bileşeni olan uzun zincirli yağ asitleri üzerine birkaç çalışma izledi . 1930'larda iki boyutlu karmaşıklığa sahip çok daha büyük moleküllerin yapıları çözülmeye başlandı. Önemli bir ilerleme, heme , corrin ve klorofil gibi biyolojide önemli olan porfirin molekülleriyle yakından ilişkili büyük bir düzlemsel molekül olan ftalosiyanin'in yapısıydı .

Biyolojik moleküllerin X-ışını kristalografisi kolesterol (1937), penisilin (1946) ve vitamin B 12'nin (1956) yapılarını çözen Dorothy Crowfoot Hodgkin ile birlikte 1964'te Nobel Kimya Ödülü'ne layık görüldü . 1969 yılında otuz yılı aşkın süredir üzerinde çalıştığı insülinin yapısını çözmeyi başardı .

Biyolojik makromoleküler kristalografi

Renkli alfa sarmallarını gösteren miyoglobin yapısının şerit diyagramı . Bu tür proteinler , binlerce atomlu uzun, doğrusal moleküllerdir ; yine de her atomun göreceli konumu, X-ışını kristalografisi ile atom altı çözünürlükle belirlendi. Tüm atomları bir kerede görselleştirmek zor olduğu için şerit, proteinin omurgasının N-ucundan (mavi) C-ucuna (kırmızı) olan kaba yolunu gösterir .

Proteinlerin kristal yapıları (düzensiz ve kolesterolden yüzlerce kat daha büyük), 1950'lerin sonlarında, Max ile Kimyada Nobel Ödülü'nü paylaştığı Sir John Cowdery Kendrew tarafından sperm balinası miyoglobin yapısıyla başlayarak çözülmeye başlandı. Perutz 1962. Bu başarıdan bu yana, proteinlerin, nükleik asitlerin ve diğer biyolojik moleküllerin 130.000'den fazla X-ışını kristal yapısı belirlenmiştir. Analiz edilen yapı sayısı bakımından en yakın rakip yöntem, onda birinden daha azını çözen nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisidir . Kristalografi keyfi olarak büyük moleküllerin yapılarını çözebilir, oysa çözelti halindeki NMR nispeten küçük olanlarla (70 k Da'dan az) sınırlıdır . X-ışını kristalografisi, farmasötik bir ilacın protein hedefiyle nasıl etkileşime girdiğini ve hangi değişikliklerin onu iyileştirebileceğini belirlemek için rutin olarak kullanılır. Bununla birlikte, intrinsik membran proteinleri , onları izole bir şekilde çözündürmek için deterjanlara veya diğer denatüre edicilere ihtiyaç duyduklarından ve bu tür deterjanlar genellikle kristalleşmeye müdahale ettiğinden, kristalleşmek için zorlu olmaya devam etmektedir . Zar proteinleri genomun büyük bir bileşenidir ve iyon kanalları ve reseptörler gibi büyük fizyolojik öneme sahip birçok proteini içerir . Helyum kriyojenikleri , protein kristallerinde radyasyon hasarını önlemek için kullanılır.

Boyut ölçeğinin diğer ucunda, nispeten küçük moleküller bile X-ışını kristalografisinin çözme gücü için zorluklar oluşturabilir. 1991 yılında bir deniz organizmasından izole edilen antibiyotiğe atanan yapının, diazonamid A (C 40 H 34 Cl 2 N 6 O 6 , molar kütle 765.65 g/mol), klasik yapı kanıtı ile yanlış olduğu kanıtlandı: sentetik bir numune doğal ürünle aynı değildi. Hata doğru -OH / -NH-NH ve tokuş ayırt X-ışını kristalografi yetersizlik atfedilen 2 yanlış yapıda / -O- grupları. Bununla birlikte, enstrümantasyondaki ilerlemelerle, modern tek kristalli X-ışını kırınım ölçerleri kullanılarak benzer gruplar ayırt edilebilir.

Yapısal biyolojide paha biçilmez bir araç olmasına rağmen , protein kristalografisi, metodolojisinde veri yorumlamasını engelleyen bazı doğal problemler taşır. Kristalizasyon işlemi sırasında oluşan kristal kafes, kristal içinde yoğun ve simetrik olarak paketlenmiş çok sayıda saflaştırılmış protein birimi içerir. Daha önce bilinmeyen bir proteini ararken, kristal kafes içindeki şeklini ve sınırlarını bulmak zor olabilir. Proteinler genellikle daha küçük alt birimlerden oluşur ve alt birimleri ayırt etme ve gerçek proteini tanımlama görevi deneyimli kristalograflar için bile zor olabilir. Kristalizasyon sırasında meydana gelen biyolojik olmayan arayüzler, kristal paketleme kontakları (veya basitçe kristal kontaklar) olarak bilinir ve kristalografik yollarla ayırt edilemez. Yeni bir protein yapısı X-ışını kristalografisi ile çözüldüğünde ve Protein Veri Bankasında depolandığında , yazarlarından fonksiyonel, biyolojik olarak ilgili proteini oluşturacak "biyolojik düzeneği" belirtmeleri istenir. Ancak, verilerin sunulması sırasındaki hatalar, eksik veriler ve hatalı açıklamalar, belirsiz yapılara neden olmakta ve veritabanının güvenilirliğini tehlikeye atmaktadır. Tek başına hatalı ek açıklamalar durumundaki hata oranının %6,6'nın üzerinde veya yaklaşık %15'in üzerinde olduğu rapor edilmiştir, bu muhtemelen depolanan yapıların sayısı dikkate alındığında önemsiz bir boyuttur. Bu "arayüz sınıflandırma sorunu" tipik olarak hesaplamalı yaklaşımlarla ele alınır ve yapısal biyoinformatikte tanınan bir konu haline gelmiştir .

saçılma teknikleri

Elastik ve esnek olmayan saçılma

X-ışını kristalografisi bir elastik saçılma şeklidir ; giden X-ışınları, gelen X-ışınları ile aynı enerjiye ve dolayısıyla aynı dalga boyuna sahiptir, sadece yön değiştirilerek. Buna karşılık, esnek olmayan saçılma , örneğin, bir iç kabuk elektronunu daha yüksek bir enerji düzeyine uyararak, gelen X-ışınından kristale enerji aktarıldığında meydana gelir . Bu tür esnek olmayan saçılma, giden ışının enerjisini azaltır (veya dalga boyunu arttırır). Esnek olmayan saçılma, maddenin bu tür uyarılmalarını araştırmak için yararlıdır, ancak X-ışını kristalografisinin amacı olan, madde içindeki saçıcıların dağılımını belirlemede değil.

X-ışınlarının dalga boyu 10 ila 0.01 nanometre arasında değişir ; kristalografi için kullanılan tipik bir dalga boyu , kovalent kimyasal bağlar ölçeğinde ve tek bir atomun yarıçapında olan 1  Å'dir (0,1 nm) . Daha uzun dalga boylu fotonlar ( morötesi radyasyon gibi ) atomik konumları belirlemek için yeterli çözünürlüğe sahip olmayacaktır. Diğer uçta, gama ışınları gibi daha kısa dalga boylu fotonların çok sayıda üretilmesi zordur, odaklanması zordur ve madde ile çok güçlü etkileşime girerek parçacık-antiparçacık çiftleri üretir . Bu nedenle, elektromanyetik radyasyonun saçılmasından atomik çözünürlüklü yapıları belirlerken X-ışınları dalga boyu için "tatlı nokta"dır .

Diğer röntgen teknikleri

Tek kristal kırınımının yanı sıra diğer elastik X-ışını saçılımı biçimleri arasında toz kırınımı , Küçük Açılı X-ışını Saçılımı ( SAXS ) ve Rosalind Franklin tarafından çift ​​sarmal yapının belirlenmesinde kullanılan çeşitli X-ışını fiber kırınımı türleri bulunur. ve DNA . Genel olarak, tek kristalli X-ışını kırınımı, bu diğer tekniklerden daha fazla yapısal bilgi sunar; bununla birlikte, her zaman mevcut olmayan, yeterince büyük ve düzenli bir kristal gerektirir.

Bu saçılma yöntemleri, genellikle , küçük sapmalarla tek bir dalga boyuyla sınırlı olan monokromatik X-ışınlarını kullanır . Laue yöntemi olarak bilinen bir teknik olan X-ışını kırınımını gerçekleştirmek için geniş bir X-ışınları spektrumu (yani, farklı dalga boylarına sahip X-ışınlarının bir karışımı) da kullanılabilir. Bu, X-ışını kırınımının orijinal keşfinde kullanılan yöntemdir. Laue saçılması, X-ışını ışınına yalnızca kısa bir maruz kalma ile çok fazla yapısal bilgi sağlar ve bu nedenle çok hızlı olayların yapısal çalışmalarında kullanılır ( Zaman çözümlü kristalografi ). Bununla birlikte, bir kristalin tam atomik yapısını belirlemek için monokromatik saçılma kadar uygun değildir ve bu nedenle nispeten basit atomik düzenlemelere sahip kristallerle daha iyi çalışır.

Laue geri yansıma modu, geniş bir spektrum kaynağından geriye doğru saçılan X-ışınlarını kaydeder. Bu, örneğin X-ışınlarının içinden iletemeyeceği kadar kalınsa yararlıdır. Kristaldeki kırınım düzlemleri, kırınım düzleminin normalinin gelen ışın ile kırınan ışın arasındaki açıyı ikiye böldüğünü bilerek belirlenir. Geri yansıma Laue fotoğrafını yorumlamak için bir Greninger şeması kullanılabilir.

Elektron ve nötron kırınımı

Elektronlar ve nötronlar gibi diğer parçacıklar, bir kırınım modeli üretmek için kullanılabilir . Elektron, nötron ve X-ışını saçılması farklı fiziksel süreçlere dayanmasına rağmen, ortaya çıkan kırınım modelleri aynı tutarlı kırınım görüntüleme teknikleri kullanılarak analiz edilir .

Aşağıda elde edildiği gibi, kristal içindeki elektron yoğunluğu ve kırınım desenleri , yoğunluğun desenlerden nispeten kolay bir şekilde hesaplanmasını sağlayan Fourier dönüşümü olan basit bir matematiksel yöntemle ilişkilidir . Ancak bu, yalnızca saçılma zayıfsa , yani saçılan ışınlar gelen ışından çok daha az yoğunsa işe yarar . Zayıf saçılan ışınlar, ikinci bir saçılma olayına uğramadan kristalin geri kalanından geçer. Bu tür yeniden saçılan dalgalara "ikincil saçılma" denir ve analizi engeller. Yeterince kalın herhangi bir kristal ikincil saçılma üretecektir, ancak X-ışınları elektronlarla nispeten zayıf etkileştiğinden, bu genellikle önemli bir sorun değildir. Buna karşılık, elektron ışınları, nispeten ince kristaller (>100 nm) için bile güçlü ikincil saçılma üretebilir. Bu kalınlık birçok virüsün çapına tekabül ettiğinden , umut verici bir yön, viral kapsidler ve moleküler makineler gibi izole edilmiş makromoleküler düzeneklerin elektron kırınımıdır ve bunlar bir kriyo- elektron mikroskobu ile gerçekleştirilebilir . Ayrıca, elektronların madde ile güçlü etkileşimi (X-ışınlarından yaklaşık 1000 kat daha güçlü), son derece küçük hacimlerin atomik yapısının belirlenmesine izin verir. Elektron kristalografisi için uygulama alanı, organik ince filmler üzerindeki membran proteinleri gibi biyo moleküllerden (nanokristalin) intermetalik bileşiklerin ve zeolitlerin karmaşık yapılarına kadar uzanır.

Nötron kırınımı, yeterli miktarlarda yoğun, monokromatik nötron demetleri elde etmek zor olsa da, yapı tespiti için mükemmel bir yöntemdir. Geleneksel olarak nükleer reaktörler kullanılmıştır, ancak parçalanma yoluyla nötron üreten kaynaklar giderek daha fazla kullanılabilir hale gelmektedir. Yüksüz oldukları için nötronlar elektronlardan ziyade atom çekirdeğinden çok daha kolay saçılır. Bu nedenle, nötron saçılımı, az elektronlu hafif atomların, özellikle de X-ışını kırınımında esasen görünmez olan hidrojenin konumlarını gözlemlemek için çok faydalıdır . Nötron saçılması ayrıca, normal su , H 2 O ve ağır su , D 2 O oranını ayarlayarak çözücünün görünmez hale getirilebilmesi gibi olağanüstü bir özelliğe sahiptir .

yöntemler

Tek kristal X-ışını kırınımına genel bakış

X-ışını kristalografisi ile bir molekülün yapısını çözmek için iş akışı.

X-ışını en eski ve en hassas bir yöntem kristalografisi olan tek-kristal X-ışını kırınımı X-ışınlan demeti dağınık kirişler üreten tek bir kristal, çarpar ki burada,. Bu ışınlar bir film parçasına veya başka bir detektöre indiklerinde, bir kırınım noktası deseni oluştururlar; kristal kademeli olarak döndürülürken bu ışınların güçleri ve açıları kaydedilir. Her noktaya yansıma denir , çünkü kristal içindeki eşit aralıklarla yerleştirilmiş bir dizi düzlemden X-ışınlarının yansımasına karşılık gelir. Yeterli saflık ve düzenliliğe sahip tek kristaller için, X-ışını kırınım verileri , sırasıyla bir angstromun birkaç binde biri ve bir derecenin birkaç onda biri içinde ortalama kimyasal bağ uzunluklarını ve açılarını belirleyebilir . Bir kristaldeki atomlar statik değildir, ancak ortalama konumları etrafında, genellikle bir angstromun birkaç onda birinden daha az salınım yapar. X-ışını kristalografisi, bu salınımların boyutunun ölçülmesini sağlar.

prosedür

Tek kristalli X-ışını kristalografisi tekniğinin üç temel adımı vardır. İlk ve genellikle en zor adım, incelenen materyalin yeterli kristalini elde etmektir. Kristal yeterince büyük (tipik olarak tüm boyutlarda 0.1 mm'den büyük), bileşimde saf ve yapı olarak düzenli olmalı , çatlaklar veya ikizlenme gibi önemli iç kusurlar olmamalıdır .

İkinci adımda, kristal, genellikle tek bir dalga boyunda ( monokromatik X-ışınları ) yoğun bir X-ışınları demetine yerleştirilir ve düzenli yansıma deseni üretilir. Kırılan X-ışınlarının açıları ve yoğunlukları, her bir bileşik benzersiz bir kırınım modeline sahip olacak şekilde ölçülür. Kristal kademeli olarak döndürüldüğünde, önceki yansımalar kaybolur ve yenileri ortaya çıkar; her noktanın yoğunluğu, kristalin her yöneliminde kaydedilir. Her bir kümenin kristalin tam dönüşünün yarısından biraz fazlasını kapsayan ve tipik olarak on binlerce yansıma içeren çoklu veri kümelerinin toplanması gerekebilir.

Üçüncü adımda, bu veriler, kristal içindeki atomların düzeninin bir modelini üretmek ve rafine etmek için tamamlayıcı kimyasal bilgilerle hesaplamalı olarak birleştirilir. Atomik düzenin son, rafine modeli - şimdi bir kristal yapı olarak adlandırılır - genellikle halka açık bir veri tabanında saklanır.

sınırlamalar

Kristalin tekrar eden birimi, birim hücresi daha büyük ve daha karmaşık hale geldikçe, X-ışını kristalografisi tarafından sağlanan atomik düzeydeki resim, belirli sayıda gözlenen yansıma için daha az iyi çözülür (daha "bulanık") hale gelir. X-ışını kristalografisinin iki sınırlayıcı durumu - "küçük molekül" (sürekli inorganik katıları içerir) ve "makromoleküler" kristalografi - genellikle ayırt edilir. Küçük molekül kristalografisi tipik olarak asimetrik birimlerinde 100'den az atom içeren kristalleri içerir ; bu tür kristal yapılar genellikle o kadar iyi çözülür ki, atomlar elektron yoğunluğunun izole edilmiş "blobları" olarak ayırt edilebilir. Buna karşılık, makromoleküler kristalografi genellikle birim hücrede on binlerce atom içerir. Bu tür kristal yapılar genellikle daha az iyi çözülür (daha fazla "bulaşmış"); atomlar ve kimyasal bağlar, izole edilmiş atomlar yerine elektron yoğunluğu tüpleri olarak görünür. Genel olarak, küçük moleküllerin kristalleşmesi makromoleküllerden daha kolaydır; bununla birlikte, X-ışını kristalografisinin, gelişmiş kristalografik görüntüleme ve teknoloji sayesinde yüz binlerce atomlu virüsler ve proteinler için bile mümkün olduğu kanıtlanmıştır . Normalde X-ışını kristalografisi yalnızca numune kristal formda ise gerçekleştirilebilirse de, numunelerin kristal olmayan formlarını örneklemek için yeni araştırmalar yapılmıştır.

kristalizasyon

Mikroskop altında görülen bir protein kristali . X-ışını kristalografisinde kullanılan kristaller, bir milimetreden daha küçük olabilir.

Kristalografi, saf olmayan veya düzensiz bir kristaldeki bozukluğu karakterize etmek için kullanılabilse de, kristalografi genellikle karmaşık bir atom düzeninin yapısını çözmek için yüksek düzenliliğe sahip saf bir kristal gerektirir. Saf, düzenli kristaller bazen metal , mineral veya diğer makroskopik malzeme örnekleri gibi doğal veya sentetik malzemelerden elde edilebilir . Bu tür kristallerin düzenliliği bazen makromoleküler kristal tavlama ve diğer yöntemlerle iyileştirilebilir . Bununla birlikte, çoğu durumda, kırınım kalitesinde bir kristal elde etmek, atomik çözünürlük yapısını çözmenin önündeki en büyük engeldir.

Küçük molekül ve makro molekül kristalografisi, kırınım kalitesinde kristaller üretmek için kullanılan olası teknikler aralığında farklılık gösterir. Küçük moleküller genellikle birkaç derecelik konformasyonel özgürlüğe sahiptir ve kimyasal buhar biriktirme ve yeniden kristalleştirme gibi çok çeşitli yöntemlerle kristalleştirilebilir . Buna karşılık, makromoleküller genellikle birçok serbestlik derecesine sahiptir ve kararlı bir yapıyı sürdürmek için kristalleşmeleri gerçekleştirilmelidir. Örneğin, proteinler ve daha büyük RNA molekülleri, üçüncül yapıları katlanmamışsa kristalleşemezler ; bu nedenle, kristalizasyon koşullarının aralığı, bu tür moleküllerin katlanmış halde kaldığı çözelti koşullarıyla sınırlıdır.

Kristalleri hazırlamanın üç yöntemi, A: Asılı damla. B: Oturarak düşme. C: Mikrodiyaliz

Protein kristalleri hemen hemen her zaman çözelti içinde büyütülür. En yaygın yaklaşım, bileşen moleküllerinin çözünürlüğünü çok kademeli olarak azaltmaktır; bu çok hızlı yapılırsa, moleküller çözeltiden çökerek kabın dibinde işe yaramaz bir toz veya amorf jel oluşturur. Çözeltideki kristal büyümesi iki adımla karakterize edilir: mikroskobik bir kristalitin (muhtemelen sadece 100 moleküle sahip) çekirdeklenmesi , ardından bu kristalitin ideal olarak kırınım kalitesinde bir kristale büyümesi . İlk adımı (çekirdeklenme) destekleyen çözüm koşulları, her zaman ikinci adımı (sonraki büyüme) destekleyen koşullarla aynı değildir. Kristalografın amacı, daha büyük kristaller molekülün gelişmiş çözünürlüğünü sunduğundan, tek, büyük bir kristalin gelişimini destekleyen çözüm koşullarını belirlemektir. Sonuç olarak, çözelti koşulları gerekir disfavor ilk adımı (çekirdeklenme), fakat tercih ikinci (büyüme), bu yüzden damlacık başına tek bir büyük kristal formları olduğu. Çekirdeklenme çok fazla tercih edilirse, damlacıkta büyük bir kristal yerine küçük kristalitlerden oluşan bir duş oluşacaktır; çok az tercih edilirse, hiçbir kristal oluşmaz. Diğer yaklaşımlar, proteinlerin yağ altında kristalleştirilmesini içerir, burada sulu protein çözeltileri sıvı yağ altında dağıtılır ve su, yağ tabakası boyunca buharlaşır. Farklı yağlar farklı buharlaşma geçirgenliklerine sahiptir, bu nedenle farklı algılayıcı/protein karışımından konsantrasyon oranlarında değişikliklere neden olur.

İyi sıralanmış kristallerin çekirdeklenmesi veya büyümesi için iyi koşulları tahmin etmek son derece zordur. Uygulamada, uygun koşullar tarama yoluyla belirlenir ; çok büyük bir molekül partisi hazırlanır ve çok çeşitli kristalizasyon çözeltileri test edilir. Başarılı olanı bulmadan önce genellikle yüzlerce, hatta binlerce çözüm koşulu denenir. Çeşitli koşullar, molekülün çözünürlüğünü azaltmak için bir veya daha fazla fiziksel mekanizma kullanabilir; örneğin, bazıları pH'ı değiştirebilir, bazıları Hofmeister serisinin tuzlarını veya çözeltinin dielektrik sabitini düşüren kimyasalları içerir ve yine diğerleri , molekülü entropik etkilerle çözeltiden uzaklaştıran polietilen glikol gibi büyük polimerler içerir . Kristalleşmeyi teşvik etmek için birkaç sıcaklık denemek veya çözeltinin aşırı doygun hale gelmesi için sıcaklığı kademeli olarak düşürmek de yaygındır. Bu yöntemler, kristalize edilecek molekül(ler)in yüksek konsantrasyonunu kullandıkları için büyük miktarlarda hedef molekül gerektirir. Bu kadar büyük miktarlarda ( miligram ) kristalizasyon dereceli protein elde etmenin zorluğundan dolayı , hacim olarak 100 nanolitre mertebesinde olan kristalizasyon deneme damlalarını doğru bir şekilde dağıtabilen robotlar geliştirilmiştir . Bu, elle yapılan kristalizasyon denemelerine kıyasla deney başına 10 kat daha az protein kullanıldığı anlamına gelir (1 mikrolitre düzeyinde ).

Çeşitli faktörlerin kristalleşmeyi engellediği veya sınırladığı bilinmektedir. Büyüyen kristaller genellikle sabit bir sıcaklıkta tutulur ve kristalleşmelerini bozabilecek şok veya titreşimlerden korunur. Moleküllerdeki veya kristalizasyon çözeltilerindeki safsızlıklar genellikle kristalleşmeye karşıdır. Moleküldeki konformasyonel esneklik, entropi nedeniyle kristalleşmeyi daha az olası hale getirme eğilimindedir. Düzenli sarmallar halinde kendi kendine bir araya gelme eğiliminde olan moleküller, genellikle kristaller halinde bir araya gelmek istemezler. Kristaller, bir birim hücre birden fazla yönde eşit derecede uygun bir şekilde toplanabildiğinde meydana gelebilecek olan ikizlenme ile gölgelenebilir ; hesaplama yöntemlerindeki son gelişmeler, bazı ikiz kristallerin yapısının çözülmesine izin verebilir. Bir hedef molekülü kristalleştirmede başarısız olan bir kristalograf, molekülün biraz değiştirilmiş bir versiyonuyla tekrar deneyebilir; moleküler özelliklerdeki küçük değişiklikler bile kristalleşme davranışında büyük farklılıklara yol açabilir.

Veri toplama

Kristalin montajı

Dört daireli bir kappa açı ölçer ile mümkün olan beş hareketi gösteren animasyon. Dört açının φ, κ, ω ve 2θ her biri etrafındaki dönüşler, kristali X-ışını ışını içinde bırakır, ancak kristal yönünü değiştirir. Dedektör (kırmızı kutu) kristalden daha yakına veya uzağa kaydırılabilir, bu da daha yüksek çözünürlüklü verilerin alınmasına (eğer daha yakınsa) veya Bragg tepelerinin daha iyi ayırt edilmesine (eğer daha uzaktaysa) izin verir.

Kristal, X-ışını ışını içinde tutulabilmesi ve döndürülebilmesi için ölçümler için monte edilmiştir. Birkaç montaj yöntemi vardır. Geçmişte kristaller, kristalizasyon solüsyonu ( ana likör ) ile cam kılcal damarlara yüklenirdi . Günümüzde, küçük moleküllerin kristalleri, tipik olarak, naylon veya plastikten yapılmış ve katı bir çubuğa tutturulmuş bir cam elyafa veya bir halkaya yağ veya yapıştırıcı ile bağlanır. Protein kristalleri bir döngü ile toplanır, ardından sıvı nitrojen ile hızlı bir şekilde dondurulur . Bu donma, X ışınlarının radyasyon hasarını ve ayrıca termal hareket nedeniyle Bragg zirvelerindeki gürültüyü (Debye-Waller etkisi) azaltır. Bununla birlikte, işlenmemiş protein kristalleri, ani dondurulduğunda genellikle çatlar; bu nedenle, genellikle dondurulmadan önce bir kriyoprotektan solüsyonda önceden ıslatılırlar. Ne yazık ki, bu ön-ıslatmanın kendisi kristalin çatlamasına neden olarak kristalografi için onu mahvedebilir. Genel olarak, başarılı kriyo koşulları deneme yanılma yoluyla belirlenir.

Kılcal damar veya halka, X-ışını ışını içinde doğru bir şekilde konumlandırılmasını ve döndürülmesini sağlayan bir açıölçer üzerine monte edilmiştir . Hem kristal hem de ışın genellikle çok küçük olduğundan, kristal, kristale odaklanan bir kamera tarafından desteklenen ~25 mikrometre hassasiyetinde ışın içinde ortalanmalıdır. En yaygın açı ölçer türü, üç dönme açısı sunan "kappa açı ölçer"dir: kirişe dik bir eksen etrafında dönen ω açısı; κ açısı, ω eksenine ~50°'lik bir eksen etrafında; ve son olarak, ilmek/kılcal eksen etrafındaki φ açısı. κ açısı sıfır olduğunda, ω ve φ eksenleri hizalanır. κ dönüşü, kristalin monte edildiği kol kristalografa doğru sallanabileceğinden, kristalin uygun şekilde monte edilmesini sağlar. Veri toplama sırasında gerçekleştirilen salınımlar (aşağıda bahsedilmiştir) yalnızca ω eksenini içerir. Daha eski bir açı ölçer türü, dört daireli açı ölçer ve altı daireli açı ölçer gibi akrabalarıdır.

X-ışını kaynakları

dönen anot

Küçük ölçekli kristalografi , tipik olarak bir görüntü plakası detektörü ile birleştirilmiş yerel bir X-ışını tüpü kaynağı ile yapılabilir . Bunlar, nispeten ucuz ve bakımı kolay olma avantajına sahiptir ve numunelerin hızlı taranmasına ve toplanmasına izin verir. Bununla birlikte, üretilen ışığın dalga boyu, farklı anot malzemelerinin mevcudiyeti ile sınırlıdır . Ayrıca yoğunluk, anodun erimesini önlemek için uygulanan güç ve mevcut soğutma kapasitesi ile sınırlıdır. Bu tür sistemlerde, elektronlar bir katottan kaynatılır ve ~50 kV'luk güçlü bir elektrik potansiyeli ile hızlandırılır  ; yüksek bir hıza ulaştıktan sonra, elektronlar bir metal plaka ile çarpışır, bremsstrahlung ve metalin iç kabuk elektronlarının uyarılmasına karşılık gelen bazı güçlü spektral çizgiler yayar . Kullanılan en yaygın metal , yüksek ısı iletkenliği nedeniyle kolayca serin tutulabilen ve güçlü K α ve K β hatları oluşturan bakırdır . K β çizgisi bazen ince (~10 µm) bir nikel folyo ile bastırılır. En basit ve en ucuz sızdırmaz X-ışını tüp çeşidinin sabit bir anot ( Crookes tüpü ) vardır ve ~2  kW elektron ışını gücü ile çalışır. Daha pahalı olan çeşit, ~14 kW e-ışın gücü ile çalışan döner anot tipi bir kaynağa sahiptir.

X-ışınları, genel olarak (kullanımı ile filtre edilir X-ışını filtreler , tek bir dalga boyunda (yapılan tek renkli) için) ve paralelleştirilmiş bunlar kristal çarpmasına izin verilmeden önce, tek bir yöne. Filtreleme yalnızca veri analizini basitleştirmekle kalmaz, aynı zamanda yararlı bilgiler sağlamadan kristali bozan radyasyonu da ortadan kaldırır. Kolimasyon, ya bir kolimatörle (temelde uzun bir tüp) ya da hafifçe kavisli aynaların akıllıca düzenlenmesiyle yapılır. Ayna sistemleri, küçük kristaller (0.3 mm'nin altında) veya büyük birim hücreli (150 Å'nin üzerinde) için tercih edilir.

Döner anotlar ile kullanılmıştır Joanna (Joka) Maria Vandenberg büyük bir tarama (gerçek zamanlı üretimi) için hızlı X ışınlarının gücü gösteren ilk deneylerde InGaAsP ince film için gofret kalite kontrol ve kuantum kuyusu lazerler .

Mikrofokus tüpü

Daha yeni bir gelişme, en az dönen anot kaynakları kadar yüksek bir ışın akışı (kolimasyondan sonra) sağlayabilen, ancak birkaç kilovat gerektirmek yerine yalnızca birkaç on veya yüzlerce wattlık bir ışın gücü gerektiren mikro odak tüpüdür .

senkrotron radyasyonu

Sinkrotron radyasyon kaynakları, dünyadaki en parlak ışık kaynaklarından bazılarıdır ve X-ışını kristalograficilerinin kullanabileceği en güçlü araçlardan bazılarıdır. Elektrik yüklü parçacıkları, genellikle elektronları, neredeyse ışık hızına kadar hızlandıran ve manyetik alanlar kullanarak (kabaca) dairesel bir döngü içinde sınırlayan, senkrotron adı verilen büyük makinelerde üretilen X-ışını ışınları .

Senkrotronlar genellikle, her biri verilerin kesintisiz olarak toplandığı birkaç özel ışın hattına sahip ulusal tesislerdir . Sinkrotronlar, başlangıçta atom altı parçacıkları ve kozmik olayları inceleyen yüksek enerjili fizikçiler tarafından kullanılmak üzere tasarlanmıştır . Her senkrotronun en büyük bileşeni elektron depolama halkasıdır. Bu halka aslında mükemmel bir daire değil, çok kenarlı bir çokgendir. Çokgenin veya sektörün her köşesinde, tam olarak hizalanmış mıknatıslar elektron akışını büker. Elektronların yolu büküldükçe, X-ışınları şeklinde enerji patlamaları yayarlar.

Sinkrotron radyasyonunun kullanılması, sıklıkla X-ışını kristalografisi için özel gereksinimlere sahiptir. Yoğun iyonlaştırıcı radyasyon , numunelerde, özellikle makromoleküler kristallerde radyasyon hasarına neden olabilir . Kriyo kristalografi , kristali sıvı nitrojen sıcaklıklarında (~100 K ) dondurarak numuneyi radyasyon hasarından korur . Bununla birlikte, senkrotron radyasyonu sıklıkla, kullanıcı tarafından seçilebilen dalga boylarının avantajına sahiptir ve anormal sinyali maksimuma çıkaran anormal saçılma deneylerine izin verir . Bu, tek dalga boyu anormal dağılım (SAD) ve çok dalga boylu anormal dağılım (MAD) gibi deneylerde kritiktir .

Serbest elektron lazeri

Serbest elektron lazerleri , X-ışını kristalografisinde kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Bunlar şu anda mevcut olan en parlak X-ışını kaynaklarıdır; femtosaniye patlamalarında gelen X-ışınları ile . Kaynağın yoğunluğu, atomik çözünürlük kırınım desenleri, aksi takdirde toplama için çok küçük kristaller için çözülebilecek şekildedir. Bununla birlikte, yoğun ışık kaynağı aynı zamanda numuneyi yok ederek birden fazla kristalin çekilmesini gerektirir. Her kristal ışında rastgele yönlendirildiğinden, eksiksiz bir veri seti elde etmek için yüz binlerce bireysel kırınım görüntüsü toplanmalıdır. Bu yöntem, seri femtosaniye kristalografisi , bazen senkrotron kaynaklarından toplanan eşdeğer yapılarla farklılıklara dikkat çekerek, bir dizi protein kristal yapısının yapısının çözülmesinde kullanılmıştır.

Yansımaları kaydetme

Kristalize bir enzimin bir X-ışını kırınım modeli. Noktaların modeli ( yansımalar ) ve her noktanın bağıl gücü ( yoğunluklar ), enzimin yapısını belirlemek için kullanılabilir.

Bir kristal monte edildiğinde ve yoğun bir X-ışınları demetine maruz kaldığında, X-ışınlarını kristalin arkasındaki bir ekranda gözlemlenebilen bir nokta veya yansıma modeline dağıtır . Benzer bir model , bir kompakt diske bir lazer işaretçi parlatıldığında da görülebilir . Bu noktaların göreceli yoğunlukları, kristal içindeki moleküllerin düzenini atomik ayrıntıda belirlemeye yönelik bilgileri sağlar. Bu yansımaların yoğunlukları, fotoğraf filmi , bir alan detektörü (bir piksel detektörü gibi ) veya bir şarj bağlantılı cihaz (CCD) görüntü sensörü ile kaydedilebilir. Küçük açılardaki tepe noktaları düşük çözünürlüklü verilere karşılık gelirken, yüksek açılardakiler yüksek çözünürlüklü verileri temsil eder; bu nedenle, yapının nihai çözünürlüğüne ilişkin bir üst sınır, ilk birkaç görüntüden belirlenebilir. Pik genişliklerinde gözlendiği gibi kristalin mozaikliği ve genel düzensizliği gibi bazı kırınım kalitesi ölçüleri bu noktada belirlenebilir . Kristalin yapıyı çözmeye elverişsiz hale getirecek bazı patolojileri de bu noktada hızlı bir şekilde teşhis edilebilir.

Tek bir nokta görüntüsü, tüm kristali yeniden yapılandırmak için yetersizdir; tam Fourier dönüşümünün yalnızca küçük bir dilimini temsil eder. Gerekli tüm bilgileri toplamak için, kristal her adımda bir görüntü kaydedilerek adım adım 180° döndürülmelidir; aslında, Ewald küresinin eğriliğinden dolayı karşılıklı uzayı kaplamak için 180°'den biraz daha fazla gereklidir . Bununla birlikte, kristalin daha yüksek bir simetrisi varsa, 90° veya 45° gibi daha küçük bir açısal aralık kaydedilebilir. Dönüş eksenine yakın karşılıklı boşlukta bir "kör nokta" oluşmasını önlemek için dönüş ekseni en az bir kez değiştirilmelidir. Daha geniş bir karşılıklı uzay bölgesini yakalamak için kristali hafifçe (0,5–2°) sallamak gelenekseldir.

Belirli fazlama yöntemleri için birden fazla veri seti gerekli olabilir . Örneğin, çok dalga boylu anormal dağılım fazlaması, saçılmanın gelen X-ışını radyasyonunun en az üç (ve genellikle dört, fazlalık için) dalga boyunda kaydedilmesini gerektirir. Tek bir kristal, radyasyon hasarı nedeniyle bir veri setinin toplanması sırasında çok fazla bozunabilir; bu gibi durumlarda, çoklu kristaller üzerindeki veri setleri alınmalıdır.

Veri analizi

Kristal simetri, birim hücre ve görüntü ölçekleme

Her biri farklı bir kristal oryantasyonuna karşılık gelen kaydedilen iki boyutlu kırınım desenleri dizisi, elektron yoğunluğunun üç boyutlu bir modeline dönüştürülür; dönüştürme, aşağıda açıklanan Fourier dönüşümlerinin matematiksel tekniğini kullanır . Her nokta, elektron yoğunluğundaki farklı bir varyasyon tipine karşılık gelir; kristalografi uzmanı, hangi varyasyonun hangi noktaya karşılık geldiğini ( dizinleme ), farklı görüntülerdeki noktaların göreli kuvvetlerini ( birleştirme ve ölçekleme ) ve toplam elektron yoğunluğunu ( fazlama ) elde etmek için varyasyonların nasıl birleştirilmesi gerektiğini belirlemelidir .

Veri işleme , yansımaların indekslenmesiyle başlar . Bu, birim hücrenin boyutlarının ve hangi görüntü tepe noktasının karşılıklı uzayda hangi konuma karşılık geldiğinin belirlenmesi anlamına gelir. İndekslemenin bir yan ürünü, kristalin simetrisini, yani uzay grubunu belirlemektir . Bazı uzay grupları baştan ortadan kaldırılabilir. Örneğin, kiral moleküllerde yansıma simetrileri gözlemlenemez; bu nedenle, neredeyse her zaman kiral olan protein molekülleri için 230 olası yalnızca 65 uzay grubuna izin verilir. İndeksleme genellikle bir otomatik indeksleme rutini kullanılarak gerçekleştirilir . Simetri atandıktan sonra veriler entegre edilir . Bu, binlerce yansımayı içeren yüzlerce görüntüyü, (en azından) her yansımanın Miller indeksinin kayıtlarından ve her yansıma için bir yoğunluktan oluşan tek bir dosyaya dönüştürür (bu durumda dosya genellikle hata tahminlerini de içerir). ve kısmilik ölçüleri (belirli bir yansımanın hangi kısmı o görüntüye kaydedildi)).

Tam bir veri seti, kristalin farklı yönlerinde çekilen yüzlerce ayrı görüntüden oluşabilir. İlk adım, bu çeşitli görüntüleri birleştirmek ve ölçeklendirmek, yani iki veya daha fazla görüntüde hangi tepe noktalarının göründüğünü belirlemek ( birleştirme ) ve göreli görüntüleri tutarlı bir yoğunluk ölçeğine sahip olacak şekilde ölçeklendirmektir. Yoğunluk ölçeğini optimize etmek kritiktir çünkü tepe noktalarının göreli yoğunluğu, yapının belirlendiği temel bilgidir. Tekrarlayan kristalografik veri toplama tekniği ve kristal malzemelerin genellikle yüksek simetrisi, difraktometrenin birçok simetri eşdeğeri yansımayı birden çok kez kaydetmesine neden olur. Bu, simetriye eşdeğer yansımaların ölçülen yoğunluklarının ne kadar benzer olduğuna dayanan bir güvenilirlik indeksi olan simetri ile ilgili R faktörünün hesaplanmasına ve böylece verilerin kalitesinin değerlendirilmesine izin verir.

İlk aşama

Bir kırınım deneyinden toplanan veriler , kristal kafesin karşılıklı uzay temsilidir. Her kırınım 'noktasının' konumu, birim hücrenin boyutu ve şekli ve kristal içindeki doğal simetri tarafından yönetilir . Her kırınım 'noktasının' yoğunluğu kaydedilir ve bu yoğunluk yapı faktörü genliğinin karesiyle orantılıdır . Yapı etken a, karmaşık sayı hem de ilgili bilgileri içeren genlik ve faz a dalga . Yorumlanabilir bir elektron yoğunluğu haritası elde etmek için , hem genlik hem de faz bilinmelidir (bir elektron yoğunluğu haritası, bir kristalografın molekülün bir başlangıç ​​modelini oluşturmasına izin verir). Faz, kırınım deneyi sırasında doğrudan kaydedilemez: bu, faz problemi olarak bilinir . İlk aşama tahminleri çeşitli yollarla elde edilebilir:

  • Ab initio fazlamaveya doğrudan yöntemler  – Bu genellikle küçük moleküller (<1000 hidrojen olmayan atom) için tercih edilen yöntemdir ve küçük proteinler için faz problemlerini çözmek için başarıyla kullanılmıştır. Verilerin çözünürlüğü 1,4 Å'den (140pm)daha iyiyse , belirli yansıma grupları arasındaki bilinen faz ilişkilerinden yararlanarak faz bilgisi elde etmek içindoğrudan yöntemlerkullanılabilir.
  • Moleküler yer değiştirme  – ilgili bir yapı biliniyorsa, moleküllerin birim hücre içindeki yönelimini ve konumunu belirlemek için moleküler değiştirmede bir arama modeli olarak kullanılabilir. Bu şekilde elde edilen fazlar, elektron yoğunluk haritaları oluşturmak için kullanılabilir.
  • Anormal X-ışını saçılması ( MAD veya SAD fazı ) - X-ışını dalga boyu, saçılımı bilinen bir şekilde değiştiren bir atomun absorpsiyon kenarından sonra taranabilir. Üç farklı dalga boyunda (soğurma kenarının çok altında, çok üstünde ve ortasında) tam yansıma setlerini kaydederek, anormal şekilde kırınım yapan atomların alt yapısı ve dolayısıyla tüm molekülün yapısı çözülebilir. Anormal saçılan atomları proteinlere dahil etmenin en popüler yöntemi, proteini selenyum atomlarıiçeren seleno-metionin açısından zengin bir ortamiçinde bir metionin oksotrofunda (metionini sentezleyemeyen bir konakçı)ifade etmektir. Daha sonra absorpsiyon kenarı çevresinde bir çok dalga boyunda anormal dağılım (MAD) deneyi yürütülebilir, bu daha sonra protein içindeki herhangi bir metionin tortusunun konumunu vererek başlangıç ​​fazlarını sağlamalıdır.
  • Ağır atom yöntemleri ( çoklu izomorf yer değiştirme ) – Elektron yoğun metal atomları kristale dahil edilebiliyorsa, konumlarını belirlemek ve başlangıç ​​fazlarını elde etmek için doğrudan yöntemler veya Patterson-uzay yöntemleri kullanılabilir. Bu tür ağır atomlar, ya kristalin ağır atom içeren bir çözeltiye batırılmasıyla ya da birlikte kristalleştirmeyle (kristallerin bir ağır atom varlığında büyütülmesiyle) dahil edilebilir. Çok dalga boylu anormal dağılım fazında olduğu gibi, saçılma genliklerindeki değişiklikler fazları verecek şekilde yorumlanabilir. Bu, protein kristal yapılarının çözüldüğü orijinal yöntem olmasına rağmen, selenometiyonin ile çok dalga boylu anormal dağılım fazlaması ile büyük ölçüde yerini almıştır.

Model oluşturma ve faz iyileştirme

Ultra yüksek çözünürlükte (0.91 Å) kristal yapı için elektron yoğunluğu içindeki kovalent bağ için çubuk figürlü bir protein alfa sarmalının yapısı. Yoğunluk konturları gri, sarmal omurga beyaz, yan zincirler camgöbeği, O atomları kırmızı, N atomları mavi ve hidrojen bağları yeşil noktalı çizgilerle.
Bir proteindeki (sarı) bir bağlanma bölgesine bağlı bir ligandın (turuncu) elektron yoğunluğunun (mavi) 3D tasviri. Elektron yoğunluğu deneysel verilerden elde edilir ve ligand bu elektron yoğunluğuna göre modellenir.

Başlangıç ​​aşamaları elde edildikten sonra bir başlangıç ​​modeli oluşturulabilir. Modeldeki atomik konumlar ve bunların ilgili Debye-Waller faktörleri (veya atomun termal hareketini hesaba katan B faktörleri ), ideal olarak daha iyi bir fazlar kümesi vererek, gözlemlenen kırınım verilerine uyacak şekilde rafine edilebilir. Daha sonra yeni elektron yoğunluğu haritasına yeni bir model sığdırılabilir ve ardışık arıtma turları gerçekleştirilir. Bu etkileşimli süreç, kırınım verileri ile model arasındaki korelasyon maksimize edilene kadar devam eder. Anlaşma, şu şekilde tanımlanan bir R faktörü ile ölçülür:

burada K bir yapı faktörü . Benzer bir kriter olup R, serbest Yapısal saflaştırma için dahil edilmemiştir yansımaları bir alt (~% 10) hesaplanır. Her iki R faktörü de verilerin çözünürlüğüne bağlıdır. Genel bir kural olarak, R serbest , yaklaşık olarak 10'a bölünen angstrom cinsinden çözünürlük olmalıdır; bu nedenle, 2 Å çözünürlüğe sahip bir veri seti, nihai bir R serbest ~ 0.2 vermelidir . Stereokimya, hidrojen bağı ve bağ uzunluklarının ve açılarının dağılımı gibi kimyasal bağ özellikleri, model kalitesinin tamamlayıcı ölçüleridir. Faz yanlılığı, bu tür yinelemeli model oluşturmada ciddi bir sorundur. Atlama haritaları , bunu kontrol etmek için kullanılan yaygın bir tekniktir.

Asimetrik birimde her atomu gözlemlemek mümkün olmayabilir. Çoğu durumda, Kristallografik düzensizlik elektron yoğunluk haritasını bozar. Hidrojen gibi zayıf saçılan atomlar rutin olarak görünmezdir. Tek bir atomun bir elektron yoğunluk haritasında birden çok kez görünmesi de mümkündür, örneğin, eğer bir protein yan zinciri birden fazla (<4) izin verilen konformasyona sahipse. Yine başka durumlarda, kristalograf, molekül için çıkarılan kovalent yapının yanlış olduğunu veya değiştiğini tespit edebilir. Örneğin, proteinler bölünebilir veya kristalizasyondan önce tespit edilmeyen translasyon sonrası modifikasyonlara maruz kalabilir.

Düzensizlik

Kristal yapıların arıtılmasında ortak bir zorluk, kristalografik bozukluktan kaynaklanır. Bozukluk birçok biçimde olabilir, ancak genel olarak iki veya daha fazla türün veya konformasyonun bir arada bulunmasını içerir. Bozukluğun tanınmaması, hatalı yorumlamaya neden olur. Bozukluğun yanlış modellenmesinden kaynaklanan tuzaklar, bağ gerilmesi izomerizminin indirgenmiş hipotezi ile gösterilmektedir . Bozukluk, bileşenlerin nispi popülasyonuna, genellikle sadece iki tanesine ve kimliklerine göre modellenir. Büyük moleküllerin ve iyonların yapılarında çözücü ve karşı iyonlar genellikle düzensizdir.

Uygulamalı hesaplamalı veri analizi

Toz X-ışını kırınım veri analizi için hesaplama yöntemlerinin kullanımı artık genelleştirilmiştir. Tipik olarak deneysel verileri, araçsal parametreleri dikkate alarak bir model yapısının simüle edilmiş kırınım grafiğiyle karşılaştırır ve en küçük kareler tabanlı minimizasyon algoritmasını kullanarak modelin yapısal veya mikroyapısal parametrelerini iyileştirir . Faz tanımlamasına ve yapısal iyileştirmeye izin veren mevcut araçların çoğu Rietveld yöntemine dayanmaktadır, bunlardan bazıları FullProf Suite, Jana2006, MAUD, Rietan, GSAS, vb. gibi açık ve ücretsiz yazılımlar iken diğerleri Diffrac gibi ticari lisanslar altında mevcuttur. Suite TOPAS, Match!, vb. Bu araçların çoğu Le Bail iyileştirmesine (profil eşleştirme olarak da anılır), yani kristalografik verileri hesaba katmadan Bragg tepe konumlarına ve tepe profillerine dayalı hücre parametrelerinin iyileştirilmesine de izin verir. yapısı kendi kendine. Daha yeni araçlar, FullProf Suite'e dahil edilen FAULTS programı gibi, hem yapısal hem de mikroyapısal verilerin iyileştirilmesine izin verir ve bu, düzlemsel kusurları olan yapıların iyileştirilmesine olanak tanır (örn. istifleme hataları, ikizler, iç içe büyümeler).

Yapının birikmesi

Bir molekülün yapısının modeli sonlandırıldıktan sonra bu, genellikle bir yatırılır kristalografik veri tabanında gibi Cambridge Yapısal Veri Tabanı (küçük moleküller için), inorganik Kristal Yapı Veri Tabanı (ICSD) (inorganik bileşikler için) veya Protein Veri Bankası ( protein ve bazen nükleik asitler için). Tıbbi olarak ilgili proteinleri kristalize etmek için özel ticari girişimlerde elde edilen birçok yapı, halka açık kristalografik veri tabanlarında depolanmaz.

kırınım teorisi

X-ışını kristalografisinin ana amacı, kristal içindeki elektronların f ( r ) yoğunluğunu belirlemektir , burada r , kristal içindeki üç boyutlu konum vektörünü temsil eder . Bunu yapmak için, formül kullanılarak gerçek uzayda tanımlanan yoğunluğu elde etmek için matematiksel olarak tersine çevrilen Fourier dönüşümü F ( q ) hakkında veri toplamak için X-ışını saçılması kullanılır.

burada integral q'nun tüm değerleri üzerinden alınır . Üç boyutlu gerçek vektör q , karşılıklı uzayda bir noktayı , yani q'nun gösterdiği yönde hareket ederken elektron yoğunluğundaki belirli bir salınımı temsil eder . q'nun uzunluğu , salınımın dalga boyuna bölünmesine karşılık gelir . Fourier dönüşümü için karşılık gelen formül aşağıda kullanılacaktır.

burada integral , kristal içindeki r konum vektörünün tüm olası değerleri üzerinden toplanır .

Fourier dönüşümü F ( q ), genellikle bir olan karmaşık sayı , ve bu nedenle sahip büyüklüğünü | F ( q )| ve denklemle ilgili bir faz φ ( q )

X-ışını kırınımında gözlemlenen yansımaların yoğunlukları bize büyüklükleri verir | F ( q )| ancak φ ( q ) evreleri değil . Fazlar elde etmek için, ya belirli bir absorpsiyon kenarını geçen dalga boyunu modüle ederek ya da cıva gibi güçlü saçılım (yani elektron yoğun) metal atomları ekleyerek, saçılmada bilinen değişikliklerle tam yansıma kümeleri toplanır . Büyüklükleri ve fazları birleştirmek, elektron yoğunluğunu f ( r ) elde etmek için tersine çevrilebilen tam Fourier dönüşümü F'yi ( q ) verir .

Kristaller genellikle mükemmel bir şekilde periyodik olarak idealleştirilir . Bu ideal durumda, atomlar mükemmel bir kafes üzerinde konumlanmıştır, elektron yoğunluğu mükemmel bir şekilde periyodiktir ve Fourier dönüşümü F ( q ), q'nun karşılıklı kafese ( Bragg tepeleri olarak adlandırılan ) ait olduğu durumlar dışında sıfırdır . Ancak gerçekte kristaller tam anlamıyla periyodik değildir; atomlar ortalama konumları etrafında titreşirler ve mozaiklik , dislokasyonlar , çeşitli nokta kusurları ve kristalize moleküllerin konformasyonunda heterojenlik gibi çeşitli tiplerde düzensizlikler olabilir . Bu nedenle, Bragg zirveleri sonlu bir genişliğe sahiptir ve Bragg zirveleri arasına düşen saçılmış X-ışınlarının sürekliliği olan önemli dağınık saçılma olabilir .

Bragg yasasına göre sezgisel anlama

Bragg kırınım modelinden X-ışını kırınımının sezgisel bir anlayışı elde edilebilir . Bu modelde, belirli bir yansıma, kristalin içinden geçen ve genellikle kristal kafesin atomlarının merkezlerinden geçen, eşit aralıklarla yerleştirilmiş bir dizi tabaka ile ilişkilidir. Belirli bir sayfa kümesinin yönü, üç Miller indeksi ( h , k , l ) ile tanımlanır ve aralıklarının d ile belirtilmesine izin verin . William Lawrence Bragg, gelen X-ışınlarının her bir düzlemden speküler olarak (ayna gibi) saçıldığı bir model önerdi; varsayımından, bitişik düzlemler saçılan x-ışınları yapıcı birleştirecek ( yapıcı girişim ) zaman uçak ve bir tam sayı katı olan bir yol uzunluğu farkı X-ışını sonuçlar arasındaki açı θ n X-ışını dalga boyuna X ve .

Bir yansıması olduğu söylenen endeksli olan Miller indisleri (veya daha doğru olarak, zaman karşılıklı kafes Vektör bileşenleri) dalga boyunda ve saçılma açısı 2θ den tanımlanmıştır. Bu tür indeksleme, birim hücre parametrelerini , birim hücrenin uzunluklarını ve açılarını ve ayrıca uzay grubunu verir . Yana Bragg kanunu yansımaları nispi yoğunluklara yorumlamak değil, ancak birim hücredeki atomların düzenlenmesi için çözmeye genellikle yetersizdir; bunun için bir Fourier dönüşümü yöntemi gerçekleştirilmelidir.

Fourier dönüşümü olarak saçılma

Gelen X-ışını ışını bir polarizasyona sahiptir ve bir vektör dalgası olarak temsil edilmelidir; ancak, basitlik için burada bir skaler dalga olarak temsil edilmesine izin verin. Ayrıca, dalganın zamana bağımlılığının karmaşıklığını görmezden geliyoruz ve sadece dalganın uzamsal bağımlılığına odaklanıyoruz. Düzlem dalgası bir ile temsil edilebilir dalga vektörü k olarak , ve zaman de gelen dalga gücü bu nedenle , t  = 0 ile verilmektedir

Numune içindeki r konumunda , saçıcıların yoğunluğu f ( r ) olsun; Bu yansiticilari küçük hacimli gelen dalga kez yerel genliğine saçıcı sayısı genliği ile orantılı bir dağınık küresel dalga üretmelidir dV ilgili r

burada S orantı sabitidir.

Çıkan bir k out dalga vektörü ile ayrılan ve ekrana r ekranında çarpan saçılan dalgaların kesirini düşünün . Hiçbir enerji kaybolmadığından (elastik, esnek olmayan saçılma değil), dalga boyları dalga vektörlerinin büyüklükleriyle aynıdır | k içinde | = | k dışarı |. Foton saçılmış olduğu zaman r en çekene kadar r ekranında , foton aşamasında bir değişime uğrar

r ekranına gelen net radyasyon , kristal boyunca saçılan tüm dalgaların toplamıdır.

Fourier dönüşümü olarak yazılabilir

nerede q = k çıkış  – k in . Yansımanın ölçülen yoğunluğu bu genliğin karesi olacaktır.

Friedel ve Bijvoet arkadaşları

Karşılıklı uzayda bir q noktasına karşılık gelen her yansıma için, karşıt noktada - q'da aynı yoğunlukta başka bir yansıma vardır . Bu zıt yansıma, orijinal yansımanın Friedel eşi olarak bilinir . Elektronların yoğunluğu matematiksel gerçeğinden Bu simetri sonuçları f ( r, bir pozisyonda) r , her zaman a, gerçek sayı . Yukarıda belirtildiği gibi, f ( r ), Fourier dönüşümünün F ( q ) ters dönüşümüdür ; bununla birlikte, böyle bir ters dönüşüm genel olarak karmaşık bir sayıdır . f ( r )'nin gerçek olmasını sağlamak için , Fourier dönüşümü F ( q ), Friedel eşleri F (− q ) ve F ( q ) birbirinin karmaşık eşleniği olacak şekilde olmalıdır. Bu nedenle, F (- q ) ile aynı büyüklüğe sahip F ( q ), ancak zıt fazlı, yani var φ ( q -) = φ ( q )

Büyüklüklerinin eşitliği, Friedel eşlerinin aynı yoğunluğa sahip olmasını sağlar | F | 2 . Bu simetri, tam Fourier dönüşümünü karşılıklı uzayın sadece yarısından, örneğin kristali tam 360 ° dönüş yerine 180 ° 'den biraz daha fazla döndürerek ölçmek için izin verir. Önemli simetriye sahip kristallerde, daha fazla yansıma aynı yoğunluğa sahip olabilir (Bijvoet arkadaşları); bu gibi durumlarda, karşılıklı boşluğun daha da azının ölçülmesi gerekebilir. Uygun yüksek simetri durumlarında, karşılıklı uzayı tamamen keşfetmek için bazen yalnızca 90° veya hatta yalnızca 45° veri gerekir.

Friedel-mate kısıtlaması, ters Fourier dönüşümünün tanımından türetilebilir.

Yana Euler formülü durumları, e i x = cos ( x ) + i sin ( x ), Fourier ters saf gerçek parçanın bir miktar ve bir saf şekilde sanal parçanın ayrılabilir dönüşümü

f ( r ) işlevi ancak ve ancak ikinci integral I sin r 'nin tüm değerleri için sıfır ise gerçektir . Buna karşılık, bu, ancak ve ancak yukarıdaki kısıtlama yerine getirildiğinde doğrudur.

beri ben günah = - Ben günah ima Ben günah  = 0.

Ewald'ın küresi

Her X-ışını kırınım görüntüsü, Ewald küre yapısında görülebileceği gibi, yalnızca bir dilimi, karşılıklı uzayın küresel bir dilimini temsil eder. Dalga boyu değişmediği için elastik saçılma nedeniyle hem k out hem de k in aynı uzunluğa sahiptir. Bu nedenle, belirli bir kırınım görüntüsünde örneklenen q değerlerini gösteren karşılıklı uzayda bir küre içinde iki radyal vektör olarak temsil edilebilirler . Gelen X-ışını demetinin gelen dalga boylarında hafif bir yayılma olduğundan, | F ( q )|yalnızca bu yarıçaplara karşılık gelen iki küre arasında yer alan q vektörleri için ölçülebilir . Bu nedenle, tam bir Fourier dönüşüm verisi elde etmek için, kristali 180°'den biraz fazla döndürmek veya yeterli simetri varsa bazen daha az döndürmek gerekir. Gerçek fonksiyonların (elektron yoğunluğu gibi) Fourier dönüşümlerine özgü bir simetri nedeniyle tam bir 360 ° dönüş gerekli değildir, ancak belirli bir çözünürlükteki tüm karşılıklı alanı kaplamak için 180 ° 'den "biraz daha fazla" gereklidir. Ewald küresinin eğriliği . Pratikte, kristal, küresel Ewald'ın kabuklarının sınırlarına yakın yansımaları birleştirmek için küçük bir miktarda (0.25–1°) sallanır.

Patterson işlevi

Fourier dönüşümlerinin iyi bilinen bir sonucu , bir f ( r ) fonksiyonunun otokorelasyonunun c ( r ) olduğunu belirten otokorelasyon teoremidir.

F ( q ) ' nin kare büyüklüğü olan bir Fourier dönüşümü C ( q ) vardır

Bu nedenle, elektron yoğunluğunun ( Patterson fonksiyonu olarak da bilinir) otokorelasyon fonksiyonu c ( r ) , fazları hesaplamadan doğrudan yansıma yoğunluklarından hesaplanabilir. Prensipte bu, kristal yapıyı doğrudan belirlemek için kullanılabilir; ancak pratikte bunu gerçekleştirmek zordur. Otokorelasyon işlevi , kristaldeki atomlar arasındaki vektörlerin dağılımına karşılık gelir ; bu nedenle, birim hücresindeki N atomlu bir kristal  , Patterson işlevinde N ( N - 1) tepe noktalarına sahip olabilir . Yoğunlukların ölçülmesindeki kaçınılmaz hatalar ve atomlar arası vektörlerden atomik konumları yeniden oluşturmanın matematiksel zorlukları göz önüne alındığında, bu teknik, en basit kristaller dışında yapıları çözmek için nadiren kullanılır.

Bir kristalin avantajları

Prensipte, kristal olmayan numunelere, hatta tek bir moleküle X-ışını saçılması uygulanarak bir atomik yapı belirlenebilir. Ancak kristaller, periyodikliklerinden dolayı çok daha güçlü bir sinyal sunarlar. Bir kristal numune tanım gereği periyodiktir; Bir kristal, üç bağımsız yönde süresiz olarak tekrarlanan birçok birim hücreden oluşur . Bu tür periyodik sistemler, Bragg tepeleri olarak bilinen karşılıklı uzayda periyodik olarak tekrar eden noktalarda yoğunlaşan bir Fourier dönüşümüne sahiptir ; Bragg tepe noktaları, kırınım görüntüsünde gözlemlenen yansıma noktalarına karşılık gelir. Bu yansımalar amplitüd numarası ile doğrusal olarak büyüdüğü N saçıcı, gözlenen yoğunluğu bu noktalar gibi, karesel büyümeli N 2 . Başka bir deyişle, bir kristal kullanmak, bireysel birim hücrelerin zayıf saçılımını, gürültünün üzerinde gözlemlenebilen çok daha güçlü, tutarlı bir yansımaya yoğunlaştırır. Bu, yapıcı müdahaleye bir örnektir .

Bir sıvı, toz veya amorf numunede, bu numune içindeki moleküller rastgele yönlerdedir. Bu tür numuneler, SAXS'de gözlemlendiği gibi, genliğini düzgün bir şekilde yayan ve böylece ölçülen sinyal yoğunluğunu azaltan sürekli bir Fourier spektrumuna sahiptir . Daha da önemlisi, oryantasyon bilgisi kaybolur. Teorik olarak mümkün olsa da, bu tür rotasyonel ortalamalı verilerden karmaşık, asimetrik moleküllerin atomik çözünürlüklü yapılarını elde etmek deneysel olarak zordur. Bir ara durum, alt birimlerin en az bir boyutta periyodik olarak düzenlendiği fiber kırınımıdır .

X-ışını kristalografisini içeren Nobel Ödülleri

Yıl ödüllü Ödül Gerekçe
1914 Max von Laue Fizik X-ışını spektroskopisinin geliştirilmesinde önemli bir adım olan "Kristaller tarafından X-ışınlarının kırınımını keşfettiği için" .
1915 William Henry Bragg Fizik " X-ışınları vasıtasıyla kristal yapının analizindeki hizmetleri için "
William Lawrence Bragg
1962 Max F. Perutz Kimya " küresel proteinlerin yapılarıyla ilgili çalışmaları için "
John C. Kendrew
1962 James Dewey Watson İlaç " Nükleik asitlerin moleküler yapısı ve canlı materyalde bilgi aktarımı için önemi ile ilgili keşifleri için"
Francis Harry Compton Crick
Maurice Hugh Frederick Wilkins
1964 Dorothy Hodgkin Kimya " Önemli biyokimyasal maddelerin yapılarının X-ışını teknikleri ile tespitleri için"
1972 Stanford Moore Kimya " Ribonükleaz molekülünün aktif merkezinin kimyasal yapısı ve katalitik aktivitesi arasındaki bağlantının anlaşılmasına katkılarından dolayı "
William H.Stein
1976 William N. Lipscomb Kimya " Kimyasal bağlanma problemlerini aydınlatan boranların yapısı üzerine yaptığı çalışmalar için "
1985 Jerome Karle Kimya " Kristal yapıların belirlenmesi için doğrudan yöntemler geliştirmedeki üstün başarılarından dolayı "
Herbert A. Hauptman
1988 Johann Deisenhofer Kimya "Bir fotosentetik reaksiyon merkezinin üç boyutlu yapısını belirlemeleri için "
Hartmut Michel Kimya
Robert Huber Kimya
1997 John E. Walker Kimya " Adenozin trifosfat (ATP) sentezinin altında yatan enzimatik mekanizmanın aydınlatılması için "
2003 Roderick MacKinnon Kimya "Hücre zarlarındaki kanallarla ilgili keşifler için [...] iyon kanallarının yapısal ve mekanik çalışmaları için "
Peter Agre "Hücre zarlarındaki kanallarla ilgili keşifler için [...] su kanallarının keşfi için "
2006 Roger D. Kornberg Kimya " Ökaryotik transkripsiyonun moleküler temeli üzerine yaptığı çalışmalar için "
2009 Ada E. Yonath Kimya " Ribozomun yapısı ve işleviyle ilgili çalışmalar için "
Thomas A. Steitz
Venkatraman Ramakrishnan
2012 Brian Kobilka Kimya " G-protein-bağlı reseptör çalışmaları için "

Uygulamalar

X-ışını kırınımı, kimyasal, biyokimyasal, fiziksel, malzeme ve mineralojik bilimlerde geniş ve çeşitli uygulamalara sahiptir. Laue 1937'de tekniğin "küçük yapıyı gözlemleme gücünü mikroskop tarafından bize verilenin on bin kat ötesine genişlettiğini" iddia etti. X-ışını kırınımı, atomları ve elektron dağılımını gösteren atomik düzeyde çözünürlüğe sahip bir mikroskoba benzer.

X-ışını kırınımı, elektron kırınımı ve nötron kırınımı, atomik ve moleküler düzeyde kristal ve kristal olmayan maddenin yapısı hakkında bilgi verir. Ayrıca, bu yöntemler, inorganik, organik veya biyolojik tüm malzemelerin özelliklerinin incelenmesinde uygulanabilir. Kristallerin kırınım çalışmalarının önemi ve uygulamalarının çeşitliliği nedeniyle, bu tür çalışmalar için birçok Nobel Ödülü verilmiştir.

İlaç tanımlama

Sekiz: X-ışını kırınımı, antibiyotik ilaçlar gibi tanımlanması için kullanılmıştır β-laktam ( sodyum ampisilin , G prokain penisilin , sefaleksin , trihidrat, ampisilin, benzatin penisilin , sodyum benzilpenisilin , sefotaksim sodyum , seftriakson, sodyum ), üç tetrasiklin ( doksisiklin hidroklorür , oksitetrasiklin dehidrat , tetrasiklin hidroklorür ) ve iki makrolid ( azitromisin , eritromisin estolat ) antibiyotik ilaçlar. Bu ilaçların her biri, tanımlanmalarını mümkün kılan benzersiz bir X-Işını Kırınım (XRD) modeline sahiptir.

Nanomalzemelerin, tekstil liflerinin ve polimerlerin karakterizasyonu

Herhangi bir iz kanıtının adli incelemesi , Locard'ın değiş tokuş ilkesine dayanır . Bu, "her temas bir iz bırakır" diyor. Uygulamada, bir malzeme transferi gerçekleşmiş olsa bile, transfer edilen miktar çok küçük olduğu için tespit edilmesi imkansız olabilir.

XRD, nanomalzeme araştırmalarının ilerlemesindeki rolünü kanıtlamıştır. Birincil karakterizasyon araçlarından biridir ve hem toz hem de ince film formundaki çeşitli nanomalzemelerin yapısal özellikleri hakkında bilgi sağlar.

Tekstil lifleri, kristal ve amorf maddelerin bir karışımıdır. Bu nedenle, kristalin derecesinin ölçümü, X-ışını difraktometrisi kullanılarak liflerin karakterizasyonunda faydalı veriler sağlar. Bir sandalyede bulunan "kristalin" bir tortuyu tanımlamak için X-ışını kırınımının kullanıldığı bildirilmiştir. Birikmenin amorf olduğu bulundu, ancak mevcut kırınım modeli, polimetilmetakrilatınkiyle eşleşti. Piroliz kütle spektrometrisi daha sonra tortuyu Boin kristal parametrelerinin polimetilsiyanoakrilaonu olarak tanımladı.

Kemiklerin araştırılması

Kemiklerin ısıtılması veya yakılması, XRD teknikleri kullanılarak tespit edilebilen kemik mineralinde fark edilebilir değişikliklere neden olur. 500 °C veya üzerinde ısıtmanın ilk 15 dakikasında kemik kristalleri değişmeye başladı. Daha yüksek sıcaklıklarda, kemik kristallerinin kalınlığı ve şekli stabilize görünür, ancak numuneler daha düşük bir sıcaklıkta veya daha kısa bir süre için ısıtıldığında, XRD izleri kristal parametrelerinde aşırı değişiklikler gösterdi.

Entegre devreler

X-ışını kırınımı, entegre devrelerin karmaşık yapısını araştırmak için bir yöntem olarak gösterilmiştir .

Ayrıca bakınız

Referanslar

daha fazla okuma

Kristalografi için Uluslararası Tablolar

  • Theo Hahn, ed. (2002). Kristalografi için Uluslararası Tablolar. Cilt A, Uzay Grubu Simetrisi (5. baskı). Dordrecht: Kluwer Academic Publishers , Uluslararası Kristalografi Birliği için . ISBN'si 0-7923-6590-9.
  • Michael G. Rossmann; Eddy Arnold, der. (2001). Kristalografi için Uluslararası Tablolar. Cilt F, Biyolojik moleküllerin kristalografisi . Dordrecht: Kluwer Akademik Yayıncılar, Uluslararası Kristalografi Birliği için. ISBN'si 0-7923-6857-6.
  • Theo Hahn, ed. (1996). Kristalografi için Uluslararası Tablolar. Cilt A'nın Kısa Öğretim Baskısı, Uzay Grubu Simetrisi (4. baskı). Dordrecht: Kluwer Akademik Yayıncılar, Uluslararası Kristalografi Birliği için. ISBN'si 0-7923-4252-6.

Ciltli makale koleksiyonları

ders kitapları

Uygulamalı hesaplamalı veri analizi

  • Genç, RA, ed. (1993). Rietveld Yöntemi . Oxford: Oxford University Press ve Uluslararası Kristalografi Birliği. ISBN'si 0-19-855577-6.

Tarihi

  • Bijvoet JM ; Burger WG; Hagg G; ed. (1969). Kristaller tarafından X-ışınlarının Kırınımına İlişkin Erken Makaleler . ben . Utrecht: A. Oosthoek'in Uitgeversmaatschappij NV tarafından Uluslararası Kristalografi Birliği için yayınlandıCS1 bakımı: ekstra metin: yazar listesi ( bağlantı )
  • Bijvoet JM; Burger WG; Hägg G, ed. (1972). Kristaller tarafından X-ışınlarının Kırınımına İlişkin Erken Makaleler . II . Utrecht: A. Oosthoek'in Uitgeversmaatschappij NV tarafından Uluslararası Kristalografi Birliği için yayınlandı
  • Bragg WL; Phillips DC ve Lipson H (1992). X-ışını Analizinin Gelişimi . New York: Dover. ISBN'si 0-486-67316-2.
  • Ewald, PP ; ve çok sayıda kristalograf, ed. (1962). Elli Yıllık X-ışını Kırınımı . Utrecht: Uluslararası Kristalografi Birliği için A. Oosthoek'in Uitgeversmaatschappij NV doi tarafından yayınlanmıştır : 10.1007/978-1-4615-9961-6 . ISBN'si 978-1-4615-9963-0.
  • Ewald, PP, editör 50 Years of X-Ray Difraction (IUCr XVIII Congress, Glasgow, İskoçya, International Union of Crystallography için pdf formatında yeniden basılmıştır).
  • Friedrich W (1922). "Geschichte der Auffindung der Röntgenstrahlinterferenzen" . Naturwissenschaften öl . 10 (16): 363. Bibcode : 1922NW.....10..363F . doi : 10.1007/BF01565289 . S2CID  28141506 .
  • Lonsdale, K (1949). Kristaller ve X-ışınları . New York: D. van Nostrand.
  • "Hayatın Yapıları". ABD Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı. 2007. Alıntı günlüğü gerektirir |journal=( yardım )

Dış bağlantılar

Öğreticiler

Birincil veritabanları

türev veritabanları

Yapısal doğrulama