Urasil-DNA glikozilaz - Uracil-DNA glycosylase
Urasil-DNA glikozilaz , UNG veya UDG olarak da bilinir . En önemli işlevi, N-glikosidik bağı parçalayarak ve baz eksizyon onarım (BER) yolunu başlatarak urasili DNA moleküllerinden elimine ederek mutajenezi önlemektir .
İşlev
İnsan geni, birkaç urasil-DNA glikozilazdan birini kodlar. Bu genin alternatif promotör kullanımı ve eklenmesi iki farklı izoforma yol açar: mitokondriyal UNG1 ve nükleer UNG2. Urasil-DNA glikosilazların önemli bir işlevi , N-glikosidik bağı parçalayarak ve baz eksizyon onarım (BER) yolunu başlatarak urasili DNA moleküllerinden elimine ederek mutajenezi önlemektir . Urasil bazları, sitozin deaminasyonundan veya dUMP kalıntılarının yanlış birleşmesinden oluşur. Bir mutasyon meydana geldikten sonra, urasil'in mutajenik tehdidi, sonraki herhangi bir DNA replikasyonu adımında yayılır . Açıldıktan sonra, uyumsuz guanin ve urasil çiftleri ayrılır ve DNA polimeraz , bir kız iplikte bir guanin-sitozin (GC) çifti ve diğerinde bir adenin -urasil (AU) çifti oluşturmak için tamamlayıcı bazlar ekler . Mutasyona uğramış şablondan türetilen tüm soy DNA'sının yarısı, mutasyon bölgesinde GC'den AU'ya bir kaymayı miras alır. UDG, baz uyumsuzluğunun aşağı akış transkripsiyon ve çeviri süreçlerine yayılmasını önlemek için hem AU hem de GU çiftlerinde urasili keser . Yüksek verimlilik ve özgüllük ile bu glikosilaz, insan hücresinde günlük olarak hasar gören 100-500 bazın onarılmasını sağlar. İnsan hücreleri , tümü DNA onarımı aracı olarak ortak bir baz eversiyonu ve eksizyon mekanizmasını paylaşan beş ila altı tip DNA glikozilaz eksprese eder .
Yapı
UDG, sekiz α-helis ile çevrili dört iplikli paralel bir β-tabakadan yapılmıştır . Aktif bölge , beş adet içermesidir korunmuş birlikte katalize motifleri glikosidik bağ bölünmesini:
- Suyla aktive olan döngü: 63-QDPYH-67
- Profesyonel açıdan zengin döngü: 165-PPPPS-169
- Urasil bağlayıcı motif: 199-GVLLLN-204
- Gly - Ser döngüsü: 246-GS-247
- Küçük oluk araya ekleme döngüsü: 268-HPSPLS-273
mekanizma
Glikozidik bağ bölünmesi, beş korunmuş motifi kullanan bir "tutama-itme-çekme" mekanizmasını takip eder.
Tutam : UDG, ipliğe spesifik olmayan bir şekilde bağlanarak ve omurgada bir bükülme oluşturarak urasil için DNA'yı tarar, böylece seçilen bazı tespit için konumlandırır. Pro-zengin ve Gly-Ser halkaları, incelenen bazın yanındaki 3' ve 5' fosfatlarla kutupsal temaslar oluşturur. DNA omurgasının bu sıkıştırması veya "tutam", UDG ile ilgi alanı arasında yakın temasa izin verir.
İtme : Nükleotid kimliğini tam olarak değerlendirmek için, interkalasyon döngüsü DNA minör oluğuna nüfuz eder veya içine iter ve nükleotidi sarmalın dışına çevirmek için bir konformasyonel değişikliği indükler . Omurga sıkıştırması, urasil bağlama motifi tarafından tanınmak üzere konumlanmış olan artık ekstrahelikal nükleotidin dışa dönmesini destekler. İnterkalasyon ve eversiyonun birleştirilmesi, DNA sarmalı içindeki uygun baz istifleme etkileşimlerinin bozulmasını telafi etmeye yardımcı olur. Leu 272, komşu bazlarla dispersiyon etkileşimleri oluşturmak ve istifleme stabilitesini yeniden sağlamak için ters çevrilmiş nükleotidin bıraktığı boşluğu doldurur.
Çekme : Artık aktif bölgeye erişilebilen nükleotid, urasil bağlama motifi ile etkileşime girer. Aktif bölge şekli, dışa dönük urasil yapısını tamamlayarak yüksek substrat spesifikliğine izin verir. Pürinler aktif bölgeye sığamayacak kadar büyüktür, diğer pirimidinlerle olumsuz etkileşimler ise alternatif substratların bağlanmasını engeller. Tyr 147'nin yan zinciri , timin C5 metil grubu ile sterik olarak etkileşirken , urasil O2 karbonil ve Gln 144 arasındaki spesifik bir hidrojen bağı , gerekli karbonilden yoksun olan bir sitozin substratına karşı ayrım yapar. Urasil bir kez tanındığında, glikozidik bağın bölünmesi aşağıdaki mekanizmaya göre ilerler.
Su nükleofilini aktive eden ve urasil ayrılan grubu protonlayan kalıntıların konumu geniş çapta tartışılmaktadır, ancak en yaygın olarak takip edilen mekanizma, enzim yapısında ayrıntılı olarak açıklanan su aktive edici döngüyü kullanır. Konumdan bağımsız olarak, aspartik asit ve histidin kalıntılarının kimlikleri, katalitik çalışmalar boyunca tutarlıdır.
Laboratuvar kullanımı
Urasil N- glikosilaz (UNG), Real-Time PCR'de taşınan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürünlerini ortadan kaldırmak için güçlü bir yöntemde kullanılan bir enzimdir . Bu yöntem, PCR ürünlerini, yeni bir reaksiyonda, önceki PCR amplifikasyonlarından kalan artık ürünler sindirilecek ve amplifikasyonu engellenecek, ancak gerçek DNA şablonları etkilenmeyecek şekilde modifiye eder. PCR, her turda bol miktarda amplifikasyon ürünü sentezler, ancak daha sonraki PCR turlarının bu ürünlerin eser miktarları ile kontaminasyonu, taşınan kontaminasyon olarak adlandırılır, yanlış pozitif sonuçlar verir. Hem PCR ürünlerinin bolluğu hem de kontaminant materyalin yeniden amplifikasyon için ideal yapısı nedeniyle, önceki bazı PCR'lerden kaynaklanan bulaşma kontaminasyonu önemli bir sorun olabilir. Bununla birlikte, taşınan kontaminasyon aşağıdaki iki adımla kontrol edilebilir: (i) dUTP'nin tüm PCR ürünlerine dahil edilmesi (dTTP yerine dUTP'nin kullanılması veya primerlerin sentezi sırasında urasil eklenmesiyle; ve (ii) tüm müteakip tamamen önceden birleştirilmiş başlangıç reaksiyonlarının işlenmesi urasil DNA glikosilaz (UDG) ile, ardından UDG'nin termal inaktivasyonu UDG, urasil bazını urasil içeren DNA'nın fosfodiester omurgasından ayırır, ancak doğal (yani timin içeren) DNA üzerinde hiçbir etkisi yoktur. DNA polimerazlar tarafından replikasyona sahiptir ve asit/baz hidrolize karşı çok kararsızdır.UDG, dTTP ile reaksiyona girmediği ve ayrıca gerçek PCR'den önce ısı denatürasyonu ile etkisiz hale getirildiği için, kontaminantlar şunları içeriyorsa, PCR'lerin taşınan kontaminasyonu etkin bir şekilde kontrol edilebilir. timinler yerine urasiller.
Urasil N- glikosilaz, eski bakterilerde devam eden düşük seviyeli metabolik aktivite ve DNA onarımının kanıtlarını saptamak için bir çalışmada da kullanıldı . Bakterilerin uzun süreli hayatta kalması, ya endospor oluşumu (bakteri hiçbir metabolik aktivite olmadan ve dolayısıyla DNA onarımı olmadan toplam uyku haline girdiği) ya da metabolik aktivitenin çok düşük bir seviyeye indirilmesi yoluyla gerçekleşebilir. Mikrobun DNA'sındaki hasarı onarabildiği ancak aynı zamanda besinleri yavaş yavaş tüketmeye devam ettiği, devam eden DNA onarımını gerçekleştirmek ve diğer kararsız moleküllerin ( ATP gibi ) tükenmesini önlemek için yeterlidir . Permafrosttaki bakterilerden alınan DNA dizileri, PCR kullanılarak büyütüldü. Bir dizi çalışma DNA dizilerini olduğu gibi büyüttü (örneklerdeki tüm canlı bakteri DNA'sını saptamak için), diğer dizi özellikle devam eden onarımdan geçen DNA'yı aradı; Bunu yapmak için, DNA, urasilleri çıkarmak için UNG ile tedavi edildi. Bu, onarılmamış DNA'nın amplifikasyonunu iki şekilde engelledi: birincisi, urasillerin çıkarılmasıyla oluşturulan abazik bölgeler , PCR'de kullanılan DNA polimerazın hasar bölgesini geçmesini engellerken, bu abazik bölgeler de DNA'yı doğrudan zayıflattı ve daha olası hale getirdi. ısıtıldığında parçalanır. Bu şekilde araştırmacılar, 600.000 yaşına kadar yüksek GC Gram pozitif bakterilerde devam eden DNA onarımının kanıtlarını gösterebildiler .
Urasil N glikosilaz ayrıca PCR ile amplifiye edilmiş DNA fragmanlarının klonlanması için bir yöntemde kullanılmıştır. Bu yöntemde PCR'de kullanılan primerler, timin yerine urasil kalıntıları ile sentezlenir. Bu primerler, PCR ile amplifiye edilmiş fragmanlara dahil edildiğinde, primer sekansı, Urasil N Glikosilaz ile sindirime duyarlı hale gelir ve uygun şekilde hazırlanmış bir vektör DNA'ya tavlanabilen 3' çıkıntılı uçlar üretir. Elde edilen kimerik moleküller, in vitro ligasyona gerek kalmadan yüksek verimlilikle yetkin hücrelere dönüştürülebilir.
Etkileşimler
Urasil-DNA glikozilazın RPA2 ile etkileşime girdiği gösterilmiştir .
