Tek molekül deneyi - Single-molecule experiment

Bir AFM kullanılarak farklı pH'ta sulu ortamda kaydedilen tek polimer molekülleri (0,4 nm kalınlığında zincirler) . Küçük bir pH değişikliğinde, polimer zincir yapısında büyük değişiklik gözlenir.

Bir tek molekül, deney bireysel özelliklerini araştıran bir deneydir moleküller . Tek moleküllü çalışmalar, moleküllerin bireysel davranışlarının ayırt edilemediği ve yalnızca ortalama özelliklerin ölçülebildiği bir molekül topluluğu veya yığın koleksiyonu üzerindeki ölçümlerle karşılaştırılabilir. Biyoloji, kimya ve fizikteki birçok ölçüm tekniği, tek molekülleri gözlemleyecek kadar hassas olmadığından, tek moleküllü floresan teknikleri (1990'lardan bu yana çeşitli süreçleri tek tek moleküller düzeyinde araştırmak için ortaya çıkmıştır) çok fazla heyecana neden oldu, çünkü bunlar geçmişte erişilemeyen ölçülen süreçlerle ilgili birçok yeni ayrıntı sağladı. Aslında, 1990'lardan beri, tek tek molekülleri araştırmak için birçok teknik geliştirilmiştir.

İlk tek molekül deneyleri 1970'lerde yapılan yama kenetleme deneyleriydi, ancak bunlar iyon kanallarını incelemekle sınırlıydı . Günümüzde, tek moleküllü teknikler kullanılarak araştırılan sistemler, miyozinin kas dokusundaki aktin filamentleri üzerindeki hareketini ve katılarda bireysel yerel ortamların spektroskopik ayrıntılarını içerir. Biyolojik polimerlerin konformasyonları atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanılarak ölçülmüştür . Kullanma kuvveti spektroskopisi , tek moleküller (veya karşılıklı etkileşim molekülleri çift), genellikle polimerlerin mekanik olarak gerilir ve elastik davranış gerçek zamanlı olarak kaydedilebilir.

Tarih

Ultra düşük basınçlarda gaz fazında, tek moleküllü deneyler onlarca yıldır yapılıyor, ancak yoğun fazda ancak 1989'dan beri WE Moerner ve Lothar Kador'un çalışmaları ile. Bir yıl sonra Michel Orrit ve Jacky Bernard, floresanslarıyla tek moleküllerin absorpsiyonunun tespitini de gösterebildiler.

Çoğu teknik, her seferinde bir molekülü gözlemleme yeteneğine sahiptir, en önemlisi tek iyonların tespit edildiği kütle spektrometrisi . Ek olarak, tek molekülleri tespit etmenin en eski yollarından biri, iyon kanalları alanında, Erwin Neher ve Bert Sakmann'ın (daha sonra seminal katkılarından dolayı Nobel ödülünü kazanmaya devam eden) yama kenetleme tekniğinin geliştirilmesiyle ortaya çıktı. Bununla birlikte, tek moleküllere bakmak için iletkenliği ölçme fikri, gözlemlenebilecek sistemlerin türüne ciddi bir sınırlama getirdi.

Floresans , çoğunlukla tek fotonları sayabilen ticari optik dedektörlerin duyarlılığından dolayı bir seferde bir molekülü gözlemlemek için uygun bir yoldur. Bununla birlikte, spektroskopik olarak, bir molekülün gözlemlenmesi, molekülün izole edilmiş bir ortamda bulunmasını ve uyarıldıktan sonra fotonları yaymasını gerektirir; bu, foto-çoğaltıcı tüpler (PMT) veya çığ fotodiyotları (APD) kullanılarak tek fotonları tespit etme teknolojisi sayesinde, foton emisyonu olaylarını büyük hassasiyet ve zaman çözünürlüğü ile kaydetmeyi sağlar.

Daha yakın zamanlarda, katalizdeki ince zamana bağlı hareketler nedeniyle toplu ölçekte kolayca çalışılamayan enzimatik işlevi incelemek için proteinler ve nükleotidler gibi biyomoleküllerin etiketlenmesi yoluyla, tek moleküllü floresan biyolojik görüntüleme için yoğun ilgi konusudur. ve yapısal yeniden yapılanma. En çok çalışılan protein, kas dokularında bulunan miyozin / aktin enzimlerinin sınıfıdır. Tek moleküllü teknikler sayesinde, bu proteinlerin çoğunda adım mekanizması gözlemlenmiş ve karakterize edilmiştir.

Atomik kuvvet mikroskobu gibi nanomanipülatörler , çoğu biyolojik polimerle aynı uzunluk ölçeğinde çalıştıkları için biyolojik önemi olan tek moleküllü deneyler için de uygundur. Ayrıca, atomik kuvvet mikroskobu (AFM), sentetik polimer molekülleri çalışmaları için uygundur. AFM, polimer zincirlerinin benzersiz bir 3B görselleştirme olanağı sağlar. Örneğin, AFM dokunma modu, sıvı ortam altında adsorbe edilmiş polielektrolit moleküllerinin (örneğin 0,4 nm kalınlığında poli (2-vinilpiridin) zincirleri) kaydedilmesi için yeterince yumuşaktır. İki zincirli süperpozisyonun konumu, bu deneylerde tek zincirin kalınlığının iki katına karşılık gelir (bahsedilen örnek durumunda 0.8 nm). Uygun tarama parametrelerinin uygulanmasında, bu tür moleküllerin konformasyonu saatlerce değişmeden kalarak çeşitli özelliklere sahip sıvı ortamlar altında deneylerin yapılmasına izin verir. Ayrıca uç ve numune arasındaki kuvvet kontrol edilerek yüksek çözünürlüklü görüntüler elde edilebilir. DNA-protein etkileşimlerini incelemek ve ölçmek için optik cımbız da kullanılmıştır.

Deneyler hakkında

Konsept

Tek moleküllü floresans spektroskopisi, ortamı, yapısı ve konumu hakkında bilgi elde etmek için bir molekülün floresansını kullanır. Teknik, topluluk ortalamasına bağlı olarak başka türlü elde edilemeyen bilgileri elde etme yeteneği sağlar (yani, aynı anda birçok molekülü kaydederken elde edilen bir sinyal, moleküllerin dinamiklerinin ortalama bir özelliğini temsil eder). Bireysel moleküllerin birçok deneyindeki sonuçlar iki durumlu yörüngelerdir .

Tek kanallı kayıt

Yama kelepçesi tekniğinin kullanıldığı tek kanallı bir kayıt deneyinden iki veri örneği (her biri ~ 10 sn). Alt iz, bu iyon kanal EC yakınındaki bir agonist konsantrasyon kaydedilir ise üst iz, daha düşük bir konsantrasyonda olduğu ₅₀ . Kanal açıklıkları aşağıya doğru sapmalarla temsil edilir, bu durumda yaklaşık 5 pA sapmalar.

Tek moleküllü floresans spektroskopisinde olduğu gibi, tek kanallı kayıt olarak bilinen teknik, tam hücre kaydı gibi toplu kayıt yapıldığında kullanılamayan belirli kinetik bilgileri elde etmek için kullanılabilir - bu durumda iyon kanalı işlevi hakkında - gerçekleştirildi. Özellikle iyon kanalları, konformasyon açısından farklılık gösteren iletken ve iletken olmayan sınıflar arasında değişir. Bu nedenle, iyon kanallarının işlevsel durumu, gürültüyü en aza indirmek için uygun önlemlerin alınması koşuluyla, yeterince hassas elektroniklerle doğrudan ölçülebilir. Buna karşılık, bu sınıfların her biri, iyon kanalının temelindeki fonksiyona doğrudan bağlı olarak bir veya daha fazla kinetik duruma bölünebilir. Bu tür tek molekül çalışmalarının sistematik olarak değişen koşullar altında gerçekleştirilmesi (örneğin, agonist konsantrasyonu ve yapısı, geçirgen iyon ve / veya kanal bloke edici, iyon kanalı amino asitlerindeki mutasyonlar), iyon kanalının çeşitli kinetik durumlarının birbirine dönüşümü ile ilgili bilgi sağlayabilir. Bir iyon kanalı için minimal bir modelde, iki durum vardır : açık ve kapalı. Bununla birlikte, verileri doğru bir şekilde temsil etmek için, uyaranın varlığında bile meydana gelebilen iletken olmayan durumlar olan aktif olmayan ve / veya duyarsızlaştırılmış durumların yanı sıra çoklu kapalı durumlar da dahil olmak üzere çoğu zaman başka durumlara ihtiyaç vardır.

Biyomolekül etiketleme

Tekli floroforlar , proteinler veya DNA gibi biyomoleküllere kimyasal olarak bağlanabilir ve tek tek moleküllerin dinamikleri, floresan probu izlenerek izlenebilir. Rayleigh sınırı içindeki mekansal hareketler , genellikle yerel ortamdaki değişiklikleri gösteren emisyon yoğunluğundaki ve / veya ışınım ömründeki değişikliklerle birlikte izlenebilir. Örneğin, tek moleküllü etiketleme, kinesin motor proteinlerinin kas hücrelerindeki mikrotübül zincirleri boyunca nasıl hareket ettiğine dair çok miktarda bilgi vermiştir .

Tek molekül floresan rezonans enerji transferi (FRET)

Ana madde smFRET .

Tek moleküllü floresan rezonans enerji transferinde molekül (en az) iki yerde etiketlenir. Bir lazer ışını, ilk probu heyecanlandıran moleküle odaklanır. Bu sonda gevşediğinde ve bir foton yaydığında, diğer sondayı heyecanlandırma şansı vardır. İkinci sondadaki birinci sondadan yayılan fotonun soğurulmasının etkinliği, bu sondalar arasındaki mesafeye bağlıdır. Mesafe zamanla değiştiği için, bu deney molekülün iç dinamiklerini araştırıyor.

Tek moleküllü deneylere karşı toplu deneyler

Tek tek moleküller ile ilgili verilere bakıldığında, genellikle birinci dereceden, ikinci dereceden vb. Yayıcılar ve atlama zamanı olasılık yoğunluk fonksiyonları oluşturulabilirken, toplu deneylerden genellikle bir korelasyon fonksiyonunun bozunması elde edilir. Bu benzersiz işlevlerin içerdiği bilgilerden (tek tek moleküllerden elde edilen), sistemin davranış şekli hakkında nispeten net bir resim elde edilebilir; örneğin kinetik şeması veya aktivite potansiyeli veya küçültülmüş boyutları formu . Özellikle, tek bir enzimin aktivitesi izlenirken, bir enzimin reaksiyon yolu (birçok özelliği) oluşturulabilir. Ek olarak, tek molekül verilerinin analizine ilişkin önemli hususlar - homojen popülasyonlar için uygun yöntemler ve testler gibi - birkaç yazar tarafından açıklanmıştır. Öte yandan, düşük gürültülü bir ortam ve yalıtılmış pipet uçlarının oluşturulması, kayıtlarda bulunan kalan istenmeyen bileşenlerin (gürültü) bazılarının filtrelenmesi ve veriler için gereken sürenin uzunluğu dahil olmak üzere tek molekül verilerinin analizi ile ilgili çeşitli sorunlar vardır. analiz (ön işleme, kesin olay tespiti, verilerin grafiğini çizme, kinetik şemaları uydurma, vb.).

Etki

Tek molekül teknikleri optik, elektronik, biyoloji ve kimyayı etkiledi. Biyolojik bilimlerde, proteinlerin ve diğer karmaşık biyolojik mekanizmaların incelenmesi, kinetiklerinin doğrudan gözlemlenmesini neredeyse imkansız kılan toplu deneylerle sınırlıydı. Örneğin, yürüme mekanizmalarının doğrudan gözleminin anlaşıldığı, kas dokusundaki kinesin-miyozin çiftlerini incelemek için tek moleküllü floresan mikroskobu kullanıldıktan sonra gerçekleşti. Bununla birlikte, canlı hücre görüntülemesi için yararlı teknikler henüz tam olarak gerçekleştirilmediği için, bu deneyler çoğunlukla in vitro çalışmalarla sınırlı kalmıştır. Bununla birlikte, tek molekül in vivo görüntüleme vaadi, doğal süreçlerde biyo-molekülleri doğrudan gözlemlemek için muazzam bir potansiyeli beraberinde getiriyor. Bu teknikler genellikle, çoğu hala keşfedilmekte olan düşük kopya proteinleri içeren çalışmaları hedeflemektedir. Bu teknikler, heterojen yüzeylerin haritalanması da dahil olmak üzere kimya çalışma alanlarına genişletilmiştir.

Languages

In other projects