Ligand bağlama deneyi - Ligand binding assay
Bir ligand bağlanma deneyi ( LBA ) bir bir analiz ya da bağlanması üzerine dayanan bir analitik prosedür, ligand molekülü için reseptörler , antikorlar ve diğer makromoleküller . Oluşan ligand-reseptör komplekslerinin varlığını ve kapsamını belirlemek için bir saptama yöntemi kullanılır ve bu genellikle elektrokimyasal olarak veya bir floresan saptama yöntemiyle belirlenir. Bu tip analitik test , reseptöre bağlandığı bilinen bir numunede hedef moleküllerin varlığını test etmek için kullanılabilir.
Hem radyoaktif hem de radyoaktif olmayan çok sayıda ligand bağlama deneyi türü vardır . Bu deneyler bir üst olan ligand bağlama radiobinding deneylerinde kavramsal tersi olan, radyo-immünodeneyler (RIA). Bazı yeni türler, bağlı olanın bağlı olmayan liganddan ayrılmasını gerektirmediği için "karıştır ve ölç" testleri olarak adlandırılır.
Ligand bağlama deneyleri, temel olarak çeşitli talepler için farmakolojide kullanılır . Spesifik olarak, insan vücudunun endojen reseptörlerine , hormonlarına ve diğer nörotransmitterlerine rağmen , farmakologlar , endojen olarak bulunan hücresel bileşenleri seçici veya taklit eden ilaçlar oluşturmak için tahlilleri kullanırlar . Öte yandan, bu tür teknikler, daha fazla kaskadları önlemek için reseptör antagonistleri oluşturmak için de mevcuttur. Bu tür ilerlemeler, araştırmacılara yalnızca hormonları ve hormon reseptörlerini ölçmek için değil, aynı zamanda ilaç geliştirme ve tedavi planlarında önemli farmakolojik bilgilere katkıda bulunma yeteneği sağlar.
Tarih
Tarihsel olarak, ligand bağlama deney teknikleri, plazma veya dokudaki hormon veya hormon reseptör konsantrasyonlarını ölçmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Ligand -bağlayıcı deney metodlar bilinmektedir protein (çeşitli miktarlarda sonuçlarına test numunesinin etkileri karşılaştırılarak test malzemesi hormon konsantrasyonu kantifiye ligandı ).
Ligand bağlama testinin temelleri , 1945'te Karl Landsteiner'in ve belirli proteinler için antikor üretimi yoluyla hayvanların bağışıklanması üzerine yaptığı çalışmanın bir sonucudur . Landsteiner'in çalışması, immünoassay teknolojisinin araştırmacıların moleküler düzeyde analiz yapmasına izin verdiğini gösterdi. İlk başarılı ligand bağlama deneyi 1960 yılında Rosalyn Sussman Yalow ve Solomon Berson tarafından rapor edilmiştir . İnsülin için ilk radyoimmünoassay (RIA) geliştirmeye ek olarak, insülin ve insüline özgü bir antikor için bağlanma etkileşimini araştırdılar . Bu keşifler, kan bazlı sıvılarda bulunan protein hormonlarının hem duyarlılığı hem de özgüllüğü hakkında değerli bilgiler sağladı. Yalow ve Berson, ilerlemelerinin bir sonucu olarak Nobel Tıp Ödülü'nü aldılar. RIA teknolojisinin gelişmesiyle, araştırmacılar radyoaktivite kullanımının ötesine geçebildiler ve bunun yerine sıvı ve katı faz, rekabetçi ve immünoradyometrik testler kullandılar. Bu anıtsal bulguların doğrudan bir sonucu olarak, araştırmacılar biyoloji, kimya ve benzeri alanlarda birçok yönden ligand bağlama deneylerinin ilerlemesini sürdürdüler.
Uygulamalar
Ligand bağlanma deneyleri, protein bağlanmaları gibi iki molekül arasında meydana gelen etkileşimlerin yanı sıra reaktanların birbirine bağlandığı afinite derecesinin (zayıf, güçlü veya bağlantı yok) bir ölçüsünü sağlar . Bağlanma tahlillerinin temel yönleri, bunlarla sınırlı olmamak üzere, reaktanların veya ürünlerin konsantrasyon seviyesini ( bkz. radyoaktif bölüm ), tahlil boyunca reaktanların denge sabitini korumayı ve bağlantılı reaksiyonların güvenilirliğini ve geçerliliğini içerir. Bağlanma deneyleri basit olsa da, test edilen bileşiğin hedefin işlevini etkileyip etkilemediği hakkında bilgi sağlamazlar.
radyoligand tahlilleri
Radyoligandlar, reseptörlere bağlanan ligandın ölçülmesi için kullanılır ve ideal olarak yüksek afiniteye, düşük spesifik olmayan bağlanmaya, düşük reseptör yoğunluklarını tespit etmek için yüksek spesifik aktiviteye ve reseptör spesifikliğine sahip olmalıdır.
Bir radyoligand (mol başına) için radyoaktivite seviyeleri, Ci/mmol cinsinden ölçülen spesifik aktivite (SA) olarak adlandırılır. Bir radyoligandın gerçek konsantrasyonu, radyoligandın (üreticilerden) kaynaklandığı özel stok karışımı tarafından belirlenir. Aşağıdaki denklem gerçek konsantrasyonu belirler:
doygunluk bağlama
Doygunluk analizi, doku homojenatlarından kısmen saflaştırılmış plazma fraksiyonları, klonlanmış reseptörlerle transfekte edilmiş hücreler ve kültürde bulunan veya analizden önce izole edilen hücreler gibi çeşitli doku türlerinde kullanılır . Doygunluk bağlama analizi, reseptör afinitesini ve yoğunluğunu belirleyebilir. Seçilen konsantrasyonun yeni bir ligand için ampirik olarak belirlenmesini gerektirir.
Bu tür deney için benimsenen iki yaygın strateji vardır: Radyoligandın hem sabit spesifik aktivitesini hem de sabit konsantrasyonunu korurken eklenen radyoligand miktarını artırmak veya etiketlenmemiş bir ligandın eklenmesi nedeniyle radyoligandın spesifik aktivitesini azaltmak.
Scatchard planı
Radyoligand afinitesini göstermek için bir Scatchard grafiği (Rosenthal grafiği) kullanılabilir. Bu tip çizimde, Bağlı/Serbest radyoligand oranı, Bağlı radyoliganda karşı çizilir. Eğim hattının negatif karşılıklı eşit afinite sabiti (K). Doğrunun X ekseni ile kesişimi, Bmax'ın bir tahminidir. Scatchard grafiği, farklı çalışmalarda ve dokularda reseptör yoğunluğunun doğrudan karşılaştırılabilmesi için uygun bir referansa göre standardize edilebilir. Bu örnek grafik, radyoligandın tek bir afinite ile bağlandığını gösterir. Ligand, farklı radyoligand afinitelerine sahip birden fazla bölgeye bağlanmış olsaydı, Scatchard grafiği bunun yerine içbükey bir çizgi gösterirdi.
Doğrusal olmayan eğri uydurma
Denge Bağlama Veri Analizi (EBDA) ve LIGAND gibi doğrusal olmayan eğri uydurma programları, doygunluk ve rekabet bağlama deneylerinden bağlama parametrelerinin tahminlerini hesaplamak için kullanılır. EBDA, ölçülen radyoaktiviteyi molar konsantrasyonlara dönüştüren ve verilerden Hill eğimleri ve Scatchard dönüşümleri oluşturan ilk analizi gerçekleştirir . EBDA tarafından yapılan analiz daha sonra LIGAND tarafından bağlama için belirli bir modeli tahmin etmek için kullanılabilir.
Rekabet bağlayıcı
Rekabetçi bağlanma, dokudaki her bir alt tipin yoğunluğunun ve oranının belirlenmesine izin veren reseptör alt tipleri için belirli bir ligand için seçiciliğin varlığını belirlemek için kullanılır. Rekabet eğrileri, toplam bağlanmanın yüzdesi olan spesifik bağlanmanın, rakip ligandın log konsantrasyonuna karşı çizilmesiyle elde edilir. Dik bir rekabet eğrisi genellikle tek bir reseptör popülasyonuna bağlanmanın göstergesidir, oysa sığ bir eğri veya net bükülme noktalarına sahip bir eğri, birden fazla bağlanma bölgesi popülasyonunun göstergesidir.
Radyoaktif olmayan bağlanma deneyleri
Radyoaktif olmayan deneyler için kullanılan farklı tekniklere rağmen, ligandların radyoaktif eşdeğerine benzer bağlanma özellikleri sergilemesini gerektirirler. Böylece, hem radyoaktif olmayan hem de radyoaktif deneylerdeki sonuçlar tutarlı kalacaktır. Radyoaktif ve radyoaktif olmayan ligand tahlilleri arasındaki en büyük farklardan biri, insan sağlığına yönelik tehlikelerle ilgilidir. Radyoaktif testler, radyoaktif atık ürettikleri için zararlıdır; oysa radyoaktif olmayan ligand deneyleri, toksik atık üretmekten kaçınmak için farklı bir yöntem kullanır. Bu yöntemler, flüoresans polarizasyonu (FP), flüoresans rezonans enerji transferi (FRET) ve yüzey plazmon rezonansı (SPR) içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir . Ligand-reseptör bağlanması sürecini ölçmek için, radyoaktif olmayan yöntemlerin çoğu, etiketlemenin moleküler etkileşimlere müdahale etmekten kaçınmasını gerektirir.
floresan polarizasyon
Floresan polarizasyonu (FP), floresan anizotropi ile eş anlamlıdır . Bu yöntem, reseptöre bağlandıktan sonra floresan etiketli bir ligandın dönüş hızındaki değişikliği ölçer. Ligandı uyarmak için polarize ışık kullanılır ve yayılan ışık miktarı ölçülür. Yayılan ışığın depolarizasyonu , bağlanan liganda (örneğin reseptöre) bağlıdır. Ligand bağlı değilse, büyük bir depolarizasyona sahip olacaktır (ligand ışığı döndürerek hızla dönmekte serbesttir). Ligand bağlıysa, birleşik daha büyük boyut, daha yavaş dönme ve dolayısıyla depolarizasyonun azalmasıyla sonuçlanır. Bu yöntemin bir avantajı, yalnızca bir etiketleme adımı gerektirmesidir. Ancak bu yöntem, düşük nanomolar konsantrasyonlarda daha az hassastır .
Floresan rezonans enerji transferi
Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET), verici ve birbirine yakın olan alıcı moleküller arasında transfer edilen enerjiyi kullanır. FRET, FP'de olduğu gibi floresan etiketli bir ligand kullanır. FRET içindeki enerji transferi, donörü uyararak başlar. Dipol-dipol etkileşimi verici ve alıcı molekül arasındaki akseptor molekülüne donörden enerji aktarır. Ligand, reseptör-antikor kompleksine bağlıysa, alıcı ışık yayacaktır. FRET kullanırken, alıcı ve verici arasında örtüşen bir absorpsiyon spektrumuna ek olarak, alıcı ve verici arasında 10 nm'den küçük bir mesafe olması ve antikorun ligand bağlama bölgesini engellememesi veya bloke etmemesi önemlidir .
Yüzey plazmon rezonansı
.jpg)
Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR), ligandın etiketlenmesini gerektirmez. Bunun yerine, polarize ışığın bir yüzeyden yansıdığı açıdaki değişimi ölçerek çalışır ( kırılma indisi ). Açı, yansıyan ışığı artıran rezonans açısını değiştiren bir ligandın hareketsizleştirilmesi gibi kütle veya kalınlık tabakasındaki değişiklik ile ilgilidir. SPR'nin türetildiği cihaz, bir sensör çipi, bir akış hücresi, bir ışık kaynağı, bir prizma ve bir sabit açılı konum detektörü içerir.
Sıvı faz bağlama deneyleri
immünopresipitasyon
İmmünopresipitasyonun (IP) sıvı faz ligand bağlama deneyi, karmaşık bir karışımdan bir antikor kullanarak belirli bir proteini veya bir protein grubunu saflaştırmak veya zenginleştirmek için kullanılan bir yöntemdir . Bozulmuş doku veya hücrelerin özü, antijen-antikor kompleksini üreten ilgili antijene karşı bir antikor ile karıştırılır. Antijen konsantrasyonu düşük olduğunda, antijen-antikor kompleksi çökelmesi saatler hatta günler alabilir ve oluşan küçük miktardaki çökeltiyi izole etmek zorlaşır.
Enzim bağlantılı immünosorbent deneyi ( ELISA ) veya Western blot , saflaştırılmış antijenin (veya çoklu antijenlerin) elde edilmesi ve analiz edilmesi için iki farklı yoldur. Bu yöntem, agaroz reçinesi gibi katı (boncuklu) bir destek üzerine eklenen bir antikor yardımıyla bir antijenin saflaştırılmasını içerir. Hareketsizleştirilmiş protein kompleksi , tek bir aşamada veya ardışık olarak gerçekleştirilebilir.
IP, biyosentetik radyoizotop etiketleme ile birlikte de kullanılabilir. Bu teknik kombinasyonu kullanılarak, belirli bir antijenin bir doku tarafından mı yoksa bir hücre tarafından mı sentezlendiği belirlenebilir.
Katı faz bağlama deneyleri
çok kuyulu plaka
Çok kuyulu plakalar, tek bir kuyucuk sayısı 6 ila 1536 arasında değişen, tek bir kap içine yerleştirilmiş çoklu petri kaplarıdır. Çok Kuyulu Plaka Testleri, gerekli dozajları ve kopyaları işlemek için uygundur. Standart bir ayak izine, destekleyici ekipmana ve ölçüm sistemlerine sahip çok çeşitli plaka türleri vardır. Elektrotlar , bağlanma deneylerinin bir sonucu olarak bilgileri yakalamak için plakaların altına entegre edilebilir. Bağlayıcı reaktifler elektrot yüzeyinde hareketsiz hale gelir ve daha sonra analiz edilebilir.
Çok kuyulu plakalar, araştırmacıların her bir çok kuyulu plaka içinde farklı türde testler (yani biyolojik testler , immün testler , vb.) oluşturmasına ve manipüle etmesine izin verecek şekilde üretilmiştir . Çok kuyulu plaka formatlamasındaki değişkenlik nedeniyle, artefaktların ortaya çıkması nadir değildir. Artefaktlar, plakadaki farklı kuyularda, özellikle kuyuların kenarlarına ve merkezine yakın yerlerde bulunan farklı ortamlardan kaynaklanmaktadır. Bu tür etkiler, iyi efektler, kenar etkileri ve plaka etkileri olarak bilinir. Böylece, tahlil tasarımlarının her bir plaka içinde ve arasında doğru şekilde konumlandırılmasının gerekliliği vurgulanmıştır.
Çok kuyulu plakaların kullanımı, in vitro biyolojik tahlil aktivitesini ölçerken veya immünoanalizler yoluyla immünoreaktiviteyi ölçerken yaygındır. Nemi azaltmak için atmosferik basınç ve sıcaklık oranlarını korumaya ek olarak, her kuyuya aynı dozda spesifik ortam uygulayarak plaka homojenliğini koruyarak artefaktlardan kaçınılabilir.
Boncuk bağlama
On-Bead Ligand Bağlanma deneyleri, tanımlanmamış süspansiyonlarda bulunan temel proteinler, DNA/RNA veya diğer biyomoleküller için izolasyon yöntemleridir ve çoklu biyokromatografik uygulamalarda kullanılabilir. Biyoaffin ligandları, terminal negatif yüklü silanol grupları veya polistiren boncukları ile silika boncuklarına kovalent olarak bağlanır ve temel proteinlerin izolasyonu ve saflaştırılması veya biyomoleküllerin adsorpsiyonu için kullanılır. Bağlandıktan sonra ayırma, santrifüjleme (yoğunluk ayırma) veya manyetik alan çekimi (yalnızca manyetik parçacıklar için) ile gerçekleştirilir. Boncuklar, iyon değiştirme yöntemleriyle çözülmeden önce izole edilen molekülün saflığını sağlamak için yıkanabilir. Enzimatik/floresan saptamaya (örn. HRP, floresan boya) dayalı doğrudan analiz yöntemleri, boncuk üzerinde belirleme veya bağlı biyomoleküllerin miktar tayini için kullanılabilir.
Sütun üstü ciltleme
Filtre
Filtre deneyleri, iki molekül arasındaki afiniteyi ölçmek için filtreler kullanan bir katı faz ligand bağlama deneyidir. Bir filtre bağlama deneyinde , filtreler, ortamı içlerinden emerek hücre zarlarını yakalamak için kullanılır. Bu hızlı yöntem, bulunan fraksiyon için filtrasyon ve geri kazanımın sağlanabildiği yüksek bir hızda gerçekleşir. Filtrelerin bir tamponla yıkanması, artık bağlanmamış ligandları ve bağlanma bölgelerinden yıkanarak uzaklaşabilen mevcut diğer ligandları uzaklaştırır. Filtre yıkanırken mevcut olan reseptör-ligand kompleksleri, filtreler tarafından tamamen tutulacaklarından önemli ölçüde ayrışmayacaktır. Filtrenin özellikleri yapılan her iş için önemlidir. Küçük membran parçalarının daha eksiksiz bir şekilde geri kazanılması için daha kalın bir filtre yararlıdır, ancak daha uzun bir yıkama süresi gerektirebilir. Negatif yüklü membran parçalarını yakalamaya yardımcı olmak için filtrelerin ön işleme tabi tutulması önerilir. Filtreye pozitif bir yüzey yükü verecek bir çözeltiye filtreyi batırmak, negatif yüklü membran parçalarını çekecektir.
Gerçek zamanlı hücre bağlama
Bu tip tahlilde, bir ligandın hücrelere bağlanması zamanla izlenir. Elde edilen sinyal, hücre yüzeyinde genellikle bir reseptör olan bir hedef yapıya bağlı ligandların sayısı ile orantılıdır. Ligand-hedef etkileşimi hakkında bilgi, zaman içindeki sinyal değişiminden elde edilir ve birleşme oranı sabiti k a , ayrışma hızı sabiti k d ve afinite K D gibi kinetik parametreler hesaplanabilir. Etkileşimi doğrudan hücreler üzerinde ölçerek, özellikle bazı zar proteinleri için zorlu olabilecek hedef proteinin izolasyonuna gerek yoktur. Amaçlanan hedef yapı ile etkileşimin ölçülmesini sağlamak için, hedef yapıyı ifade etmeyen hücreler gibi uygun biyolojik kontroller önerilir.
Sabitlenmiş veya canlı hücreler üzerindeki biyomoleküler etkileşimleri analiz etmek için etiketsiz veya etiket tabanlı yaklaşımlar kullanan gerçek zamanlı ölçümler kullanılmıştır.
Ligand-reseptör etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak ölçmenin avantajı, afinitenin doğru belirlenmesi için bağlanma dengesine ulaşılmasına gerek olmamasıdır.
bağlama özgüllüğü
Bir ilacın etkileri, bir organizmanın makromolekül özellikleri ile bağlanma seçiciliğinin veya farklı ligandların bir substrata bağlanma afinitesinin bir sonucudur . Daha spesifik olarak, bir ligandın ilgili reseptörüne özgüllüğü ve seçiciliği , araştırmacılara ligand konsantrasyonlarının ve reseptör yoğunluklarının manipülasyonu yoluyla spesifik ilaç etkilerini izole etme ve üretme fırsatı sağlar. Hormonlar ve nörotransmitterler, bir organizma içindeki fizyolojik reseptörleri etkileyen temel endojen düzenleyici ligandlardır. Bu reseptörler üzerinde etkili olan ilaçlar, sinyal moleküllerinden gerekli tepkileri üretmek için inanılmaz derecede seçicidir.
Spesifik bağlanma, bir ligandın bir reseptöre bağlanmasını ifade eder ve bir ligand için birden fazla spesifik bağlanma sahası olması mümkündür. Spesifik olmayan bağlanma, bir ligandın, çeşitli diğer reseptörler veya hücre zarındaki farklı taşıyıcı türleri gibi belirlenmiş reseptöründen başka bir şeye bağlanmasını ifade eder. Örneğin, çeşitli antagonistler, birden çok tipte reseptöre bağlanabilir. Muskarinik antagonistler durumunda, histamin reseptörlerine de bağlanabilirler. Ligandın hedefi çoklu reseptörlere özel olduğundan, bu tür bağlanma paternleri teknik olarak spesifik olarak kabul edilir. Ancak, araştırmacılar diğer bağlayıcı faktörlere kıyasla bu tür davranışlara odaklanmayabilir. Bununla birlikte, spesifik olmayan bağlanma davranışı elde edilmesi çok önemli bir bilgidir. Bu tahminler, bir ligandın bir reseptöre nasıl bağlandığını ve aynı anda spesifik bağlanmanın oluşmasını önleyecek bir ikame ajana (antagonist) tepkimeye nasıl girdiğini inceleyerek ölçülür.
Ligand ve reseptör etkileşimlerine spesifik bağlanma türleri:
| Endojen Etkileri Taklit Eder | Endojen Etkileri Engeller |
|---|---|
| agonist | Rakip |
| Kısmi Agonist | Negatif Antagonistler (bkz: Ters agonist ) |
teknolojik gelişmeler
Ligand bağlama deneyi teknolojileri, doğruluğu ve hassasiyeti korurken ve artırırken hızın arttırılması ve uygun maliyetli prosedürlerin sürdürülmesi ile ilgili olarak ilerlemeye devam etmektedir. Bazı teknolojik gelişmeler arasında antikorlara alternatif olarak yeni bağlama reaktifleri, alternatif boya çözeltileri ve mikro plaka sistemleri ve birçok ligand bağlama tahlili işleminde gerekli olan filtrasyon adımını atlamak için bir yöntemin geliştirilmesi yer almaktadır.
Hücrelerde öne çıkan bir sinyal molekülü, Fluo-4 asetoksimetil boyası ile saptanabilen Kalsiyumdur (Ca2 + ) . Serbest Ca2 + iyonlarına bağlanır ve bu da Fluo-4 AM'nin floresansını hafifçe artırır. Fluo-4 boya formülasyonunun dezavantajı, istenmeyen arka plan sinyalleri sağlayabilen hücre dışı boyayı çıkarmak için bir yıkama aşamasının gerekli olmasıdır. Örneğin, yıkama, hücreler üzerinde ek stres oluşturmasının yanı sıra, zaman tüketerek, zamanında bir analiz yapılmasını engeller. Son zamanlarda, bir yıkama adımı gerektirmeyen bir Kalsiyum 3 tahlil reaktifi kullanan FLIPR® (florometrik görüntüleme plakası okuyucu) adı verilen alternatif bir boya solüsyonu ve mikroplaka sistemi geliştirilmiştir. Sonuç olarak, boya floresansındaki değişiklik, uyarıcı bir lazer ve şarj bağlantılı bir cihaz kullanılarak gecikme olmaksızın gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir .
Birçok ligand bağlama deneyi, taramadan önce bağlı ve bağlı olmayan ligandları ayırmak için bir süzme adımı gerektirir. Yakın zamanda Sintilasyon yakınlık testi (SPA) adı verilen ve aksi takdirde çok önemli olan bu adımı ortadan kaldıran bir yöntem geliştirilmiştir. Ligand bağlama molekülleri ile kaplanmış ve seryum iyonları ile doldurulmuş kristal kafes boncuklar aracılığıyla çalışır . Bunlar, kolayca ölçülebilen bir izotop tarafından uyarıldığında ışık patlamaları yayar. Ligandlar ya 3H ya da 125I kullanılarak radyo-etiketlenir ve tahlile bırakılır. Sadece boncuklara doğrudan bağlanan radyoligandlar bir sinyal başlattığından, serbest ligandlar tarama işlemi sırasında karışmaz.
sınırlamalar
Doğası gereği, testler in vitro kontrollü bir ortamda gerçekleştirilmelidir, bu nedenle bu yöntem in vivo reseptör bağlanması hakkında bilgi sağlamaz. Elde edilen sonuçlar yalnızca belirli bir ligandın bir reseptöre uyduğunu doğrulayabilir, ancak tahliller bir organizmada ligand bağlayıcı reseptörlerin dağılımını bilmenin hiçbir yolunu sağlamaz.
In vivo ligand bağlanması ve reseptör dağılımı, bir radyonüklidin bir liganda indüklenmesiyle çalışan ve daha sonra çalışılan bir organizmanın vücuduna salınan Pozitron Emisyon Tomografisi (PET) kullanılarak incelenebilir. Radyoetiketli ligandlar, organizmada yüksek konsantrasyonlarda reseptör bulunan alanları ortaya çıkarmak için bir PET tarayıcı tarafından uzaysal olarak konumlandırılır.