Protein çökelmesi - Protein precipitation

Protein çökeltme , proteinleri konsantre etmek ve onları çeşitli kirleticilerden arındırmak için biyolojik ürünlerin sonraki işlemlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır . Örneğin, biyoteknoloji endüstrisinde protein çökelmesi, kanda yaygın olarak bulunan kirletici maddeleri ortadan kaldırmak için kullanılır. Çökelmenin altında yatan mekanizma , çözücünün çözme potansiyelini , daha spesifik olarak, bir reaktif ilavesiyle çözünen maddenin çözünürlüğünü düşürerek değiştirmektir .

Genel İlkeler

Çözünürlük sulu tamponlar içinde proteinlerin dağılımına bağlıdır hidrofilik ve hidrofobik proteinin yüzeyi üzerindeki amino asit kalıntıları. Hidrofobik kalıntılar ağırlıklı olarak küresel protein çekirdeğinde meydana gelir, ancak bazıları yüzeydeki yamalar halinde bulunur. Yüzeyde yüksek hidrofobik amino asit içeriğine sahip proteinler, sulu bir çözücü içinde düşük çözünürlüğe sahiptir. Yüklü ve polar yüzey kalıntıları, çözücüdeki iyonik gruplarla etkileşime girer ve bir proteinin çözünürlüğünü arttırır. Bir proteinin amino asit bileşiminin bilgisi, ideal bir çökeltme çözücüsü ve yöntemlerinin belirlenmesine yardımcı olacaktır.

İtici elektrostatik kuvvet

İtici elektrostatik kuvvetler, proteinler bir elektrolit çözeltisinde çözüldüğünde oluşur . Proteinler arasındaki bu itici kuvvetler, kümeleşmeyi önler ve çözünmeyi kolaylaştırır. Bir elektrolit çözeltisinde çözüldükten sonra, çözücü karşı iyonları protein üzerindeki yüklü yüzey kalıntılarına doğru hareket ederek proteinin yüzeyinde sert bir karşı iyon matrisi oluşturur. Bu katmanın yanında, daha az sert olan ve protein yüzeyinden uzaklaştıkça azalan bir karşı iyon konsantrasyonu ve artan bir ko-iyon konsantrasyonu içeren başka bir solvasyon katmanı vardır. Bu solvasyon katmanlarının varlığı, proteinin diğer proteinlerle daha az iyonik etkileşime sahip olmasına neden olur ve kümelenme olasılığını azaltır. İtici elektrostatik kuvvetler, proteinler suda çözündüğünde de oluşur. Su, bir proteinin hidrofilik yüzey kalıntılarının etrafında bir solvasyon tabakası oluşturur. Su, protein yüzeyinde en yüksek konsantrasyonla protein etrafında bir konsantrasyon gradyanı oluşturur. Bu su şebekesinin, proteinler arasındaki çekici kuvvetler üzerinde bir sönümleme etkisi vardır.

• 

  İyonik çözme tabakası

• 

  Hidrasyon tabakası

Çekici elektrostatik kuvvet

Kalıcı ve indüklenmiş dipoller yoluyla proteinler arasında dağıtıcı veya çekici kuvvetler mevcuttur . Örneğin, bir protein üzerindeki bazik kalıntılar, başka bir protein üzerindeki asidik kalıntılarla elektrostatik etkileşimlere sahip olabilir. Bununla birlikte, bir elektrolitik çözelti veya su içindeki iyonların çözülmesi, protein-protein çekme kuvvetlerini azaltacaktır. Bu nedenle, proteinlerin çökelmesi veya birikmesine neden olmak için, proteinin etrafındaki hidrasyon tabakası azaltılmalıdır. Protein çökelmesinde eklenen reaktiflerin amacı hidrasyon katmanını azaltmaktır.

• 

  Hidrasyon tabakası

Çökelti oluşumu

Protein çökeltisi oluşumu aşamalı bir süreçte meydana gelir. İlk önce bir çökeltme ajanı eklenir ve çözelti sürekli olarak karıştırılır. Karıştırma, çökeltici ve proteinin çarpışmasına neden olur. Moleküllerin sıvı girdapları boyunca dağılması için yeterli karıştırma süresi gereklidir. Daha sonra proteinler , mikroskobik boyutta protein kümelerinin veya parçacıklarının üretildiği bir çekirdeklenme aşamasına girer. Bu parçacıkların büyümesi Brownian difüzyon kontrolü altındadır. Parçacıklar , ayrı ayrı protein moleküllerinin difüzif olarak eklenmesiyle kritik bir boyuta ( sırasıyla yüksek ve düşük kesme alanları için 0.1 um ila 10 um) ulaştığında , birbirlerine çarparak ve yapışarak veya topaklaşarak büyümeye devam ederler . Bu aşama daha yavaş bir hızda gerçekleşir. Kesme alanında yaşlanma olarak adlandırılan son adımda, çökelti partikülleri tekrar tekrar çarpışır ve yapışır, ardından tek tek proteinlere bağlı olan sabit bir ortalama partikül boyutuna ulaşılana kadar parçalanır. Protein parçacıklarının mekanik mukavemeti, Kamp numarası olarak bilinen ortalama kesme hızı ve yaşlanma süresinin ürünü ile ilişkilidir. Yaşlanma, partiküllerin boyutlarını küçültmeden pompalarda ve santrifüj besleme bölgelerinde karşılaşılan akışkan kesme kuvvetlerine dayanmasına yardımcı olur.

Yöntemler

Tuzlama

Tuzlama , bir proteini çökeltmek için kullanılan en yaygın yöntemdir. Amonyum sülfat gibi nötr bir tuzun eklenmesi solvasyon katmanını sıkıştırır ve protein-protein etkileşimlerini artırır. Bir çözeltinin tuz konsantrasyonu arttıkça, proteinin yüzeyindeki yükler suyla değil, tuzla etkileşime girerek protein yüzeyindeki hidrofobik yamaları açığa çıkararak proteinin çözeltiden düşmesine (kümelenme ve çökelme) neden olur.

Tuzlamayla ilgili enerji

Tuzlama , çözeltide doğru tuz konsantrasyonuna ulaşıldığında kendiliğinden oluşan bir süreçtir . Protein yüzeyindeki hidrofobik yamalar, oldukça düzenli su kabukları oluşturur. Bu , toplu çözelti içindeki moleküllere göre düzenli su moleküllerinin entalpi , Δ H'de küçük bir azalma ve entropi Δ S'de daha büyük bir düşüşle sonuçlanır. Sürecin genel serbest enerji değişimi, Δ G , Gibbs serbest enerji denklemi tarafından verilir:

${\ displaystyle \ Delta G = \ Delta HT \ Delta S.}$

Δ G = Serbest enerji değişimi, Δ H = Yağışla entalpi değişimi, Δ S = Yağışla entropi değişimi, T = Mutlak sıcaklık. Katı çözme katmanındaki su molekülleri, eklenen tuzla etkileşimler yoluyla toplu faza geri getirildiğinde, daha fazla hareket serbestliği, entropilerinde önemli bir artışa neden olur. Böylece, Δ G negatif olur ve çökelme kendiliğinden gerçekleşir.

Hofmeister serisi

Kosmotroplar veya "su yapısı stabilizatörleri", bir protein etrafındaki solvasyon katmanından suyun yayılmasını / dağılmasını destekleyen tuzlardır. Hidrofobik yamalar daha sonra proteinin yüzeyinde açığa çıkar ve diğer proteinler üzerindeki hidrofobik yamalar ile etkileşime girer. Bu tuzlar, protein toplanmasını ve çökelmesini arttırır. Kaotroplar veya "su yapısı kırıcılar", Kosmotropların zıt etkisine sahiptir. Bu tuzlar, bir proteinin etrafındaki çözme katmanında bir artışı teşvik eder. Kosmotropik tuzların çökeltici proteinlerdeki etkinliği Hofmeister serisinin sırasını takip eder:

En çok yağış en az yağış ${\ displaystyle \ mathrm {PO_ {4} ^ {3 -}> SO_ {4} ^ {2 -}> COO ^ {-}> Cl ^ {-}}}$

En çok yağış en az yağış ${\ displaystyle \ mathrm {NH_ {4} ^ {+}> K ^ {+}> Na ^ {+}}}$

Pratikte tuzlama

Protein çözünürlüğündeki azalma, gösterilen tipte normalleştirilmiş bir çözünürlük eğrisini takip eder . Bir proteinin çözünürlüğü ile çözeltinin artan iyonik gücü arasındaki ilişki Cohn denklemi ile gösterilebilir:

${\ displaystyle \ log S = B-KI \,}$

S = proteinin çözünürlüğü, B idealleştirilmiş çözünürlük, K tuza özgü sabit ve I çözeltinin eklenen tuza atfedilen iyonik gücüdür.

${\ displaystyle I = {\ begin {matrix} {\ frac {1} {2}} \ end {matrix}} \ sum _ {i = 1} ^ {n} c_ {i} z_ {i} ^ {2 }}$

Z _ı tuz iyon yükü ve c _i tuz konsantrasyonu. Protein çökeltmesi için ideal tuz, belirli bir amino asit bileşimi için en etkilidir, ucuzdur, tamponlayıcı değildir ve kirletmez. En yaygın kullanılan tuz amonyum sülfattır . 0 ° C ile 30 ° C arasındaki sıcaklıklarda tuzlamada düşük bir varyasyon vardır. Tuz çözeltisinde kalan protein çökeltileri , yüksek tuz konsantrasyonları ile proteoliz ve bakteriyel kontaminasyondan yıllarca korunarak stabil kalabilir .

• 

  Çözünürlük eğrisi

İzoelektrik çökelme

İzoelektrik nokta (pl) bir proteinin net birincil yük sıfır hale geldiği bir çözelti pH'ıdır. Pl'nin üzerindeki bir çözelti pH'ında, proteinin yüzeyi ağırlıklı olarak negatif yüklüdür ve bu nedenle benzer yüklü moleküller itici kuvvetler sergileyecektir. Benzer şekilde, pl'nin altındaki bir çözelti pH'ında, proteinin yüzeyi ağırlıklı olarak pozitif yüklüdür ve proteinler arasında itme meydana gelir. Bununla birlikte, pl'de negatif ve pozitif yükler birbirini götürür, itici elektrostatik kuvvetler azalır ve çekim kuvvetleri baskındır. Çekme kuvvetleri kümelenmeye ve çökelmeye neden olacaktır. Çoğu proteinin pl'si 4–6 pH aralığındadır. Çökeltici olarak hidroklorik ve sülfürik asit gibi mineral asitler kullanılır. İzoelektrik nokta çökelmesinin en büyük dezavantajı , mineral asitlerin neden olduğu geri dönüşü olmayan denatürasyondur . Bu nedenle, izoelektrik nokta çökelmesi, çoğunlukla hedef protein yerine kirletici proteinleri çökeltmek için kullanılır. Peynir yapımı sırasında veya sodyum kazeinat üretimi sırasında kazeinin çökelmesi, izoelektrik bir çökelmedir.

Karışabilir çözücülerle çökelme

İlavesi ile karışabilen gibi çözücüler , etanol veya metanol çözeltisine çökelti çözeltisi içinde proteinlerin neden olabilir. Organik çözücü, suyu protein yüzeyinden aşamalı olarak uzaklaştırdıkça ve organik çözücü molekülleri etrafındaki hidrasyon katmanlarına bağladıkça, proteinin etrafındaki solvasyon tabakası azalacaktır. Daha küçük hidrasyon katmanları ile proteinler, çekici elektrostatik ve çift kutuplu kuvvetlerle toplanabilir. Göz önünde bulundurulması gereken önemli parametreler , çözeltide denatürasyon , pH ve protein konsantrasyonunu önlemek için 0 ° C'den düşük olması gereken sıcaklıktır . Karışabilir organik çözücüler , suyun dielektrik sabitini düşürür , bu da aslında iki proteinin birbirine yaklaşmasına izin verir. En izoelektrik noktası Dielektrik sabiti ve protein çözünürlüğü arasındaki ilişki ile verilir:

${\ displaystyle \ log S = k / e ^ {2} + \ log S ^ {0} \,}$

S ⁰ olan ekstrapolasyonlu bir değerdir S , E karışımının dielektrik sabitidir ve k, su dielektrik sabiti ile ilgilidir bir sabittir. Cohn işlem plazma protein fraksiyonasyonu için tek tek plazma proteinleri izole etmek için etanol ile, çözücü çökelmesi ile dayanır.

bir protein çökeltme maddesi olarak metanol kullanımına yönelik bir klinik uygulama, bilirubin tahmininde yer almaktadır.

İyonik olmayan hidrofilik polimerler

Dekstranlar ve polietilen glikoller gibi polimerler , düşük yanıcılığa sahip oldukları ve biyomateryalleri izoelektrik çökeltmeden daha az denatüre ettikleri için proteinleri çökeltmek için sıklıkla kullanılırlar. Çözeltideki bu polimerler, su moleküllerini proteinin etrafındaki çözme katmanından uzaklaştırır. Bu, protein-protein etkileşimlerini artırır ve çökelmeyi artırır. Polietilen glikolün özel durumu için, çökelme aşağıdaki denklemle modellenebilir:

${\ displaystyle \ ln (S) + pS = X-aC \,}$

C polimer konsantrasyonudur, P bir protein-protein etkileşim katsayısıdır, a bir protein-polimer etkileşim katsayısıdır ve

${\ displaystyle x = (\ mu _ {i} - \ mu _ {i} ^ {0}) RT}$

μ olan kimyasal potansiyel bileşen I, R, bir evrensel gaz sabiti ve T , mutlak sıcaklıktır.

Polielektrolitlerle flokülasyon

Aljinat , karboksimetilselüloz, poliakrilik asit, tanik asit ve polifosfatlar, solüsyondaki protein molekülleri arasında genişletilmiş ağlar oluşturabilir. Bu polielektrolitlerin etkinliği, çözeltinin pH'ına bağlıdır. Anyonik polielektrolitler, izoelektrik noktadan daha düşük pH değerlerinde kullanılır. Katyonik polielektrolitler, pl'nin üzerindeki pH değerlerinde bulunmaktadır. Fazla polielektrolitin çökeltinin tekrar çözelti içinde çözünmesine neden olacağına dikkat etmek önemlidir. Polielektrolit flokülasyonunun bir örneği, protein bulutunun İrlanda yosunu kullanılarak bira şırasından uzaklaştırılmasıdır .

Çok değerlikli metalik iyonlar

Çözeltilerden enzimleri ve nükleik asitleri çökeltmek için düşük konsantrasyonlarda metal tuzları kullanılabilir . Sık kullanılan çok değerlikli metal iyonları Ca ²⁺ , Mg ²⁺ , Mn ²⁺ veya Fe ^{2+ 'dir} .

Çökeltme reaktörleri

Bir solüsyondan rekombinant DNA polimerazlar gibi büyük miktarlarda proteini çökeltmek için kullanılabilecek çok sayıda endüstriyel ölçekli reaktör vardır . [1]

Kesikli reaktörler

Kesikli reaktörler, en basit çökeltme reaktörü türüdür. Çökeltici ajan, karıştırılarak protein çözeltisine yavaşça ilave edilir. Kümelenen protein parçacıkları, kompakt ve düzenli olma eğilimindedir. Parçacıklar uzun bir süre boyunca çok çeşitli kesme gerilimlerine maruz kaldıklarından, kompakt, yoğun ve mekanik olarak kararlı olma eğilimindedirler.

Borulu reaktörler

Boru şeklindeki reaktörlerde, besleme proteini çözeltisi ve çökeltici reaktif, verimli bir karıştırma bölgesinde temas ettirilir ve ardından çökelmenin gerçekleştiği uzun tüplere beslenir. Hacim elemanlarındaki akışkan , reaktörün tüpleri arasında hareket ettikçe tıpa akışına yaklaşır . Türbülanslı akış, tüpteki tel örgü ekler aracılığıyla desteklenir. Borulu reaktör hareketli mekanik parçalar gerektirmez ve yapımı ucuzdur. Bununla birlikte, parçacıklar yavaşça bir araya gelirse reaktör pratik olmayan bir şekilde uzayabilir.

Sürekli karıştırılan tank reaktörleri (CSTR)

CSTR reaktörleri, iyi karıştırılmış bir tankta sürekli bir reaktan ve ürün akışı ile kararlı durumda çalışır . Taze protein yemi , zaten çökelti partikülleri ve çökeltme reaktifleri içeren bulamaçla temas eder.

Referanslar

• Zellner; et al. (Haziran 2005). "Kan trombositlerinin proteom analizinde farklı protein çökeltme yöntemlerinin kantitatif doğrulaması". Elektroforez . 26 (12): 2481–9. doi : 10.1002 / elps.200410262 . PMID   15895463 .
• Harrison ve diğerleri, Bioseparations Science and Engineering. Oxford University Press. New York, NY 2003.
• Shuler ve diğerleri, Bioprocess Engineering: Basic Concepts (2. Baskı). Prentice Hall Uluslararası. 2001
• Ladisch. Biyoayırma Mühendisliği . John Wiley & Sons, Inc. New York, NY 2001.
• Lydersen. Biyoproses Mühendisliği. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY 1994.
• Belter, Paul A. Bioseparations: biyoteknoloji için sonraki işlemler. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY 1988.