Protein kristalizasyonu - Protein crystallization

Proteinlerin Kristaller yetiştirilen ABD uzay mekiği veya Rus Uzay İstasyonu, Mir .

Protein kristalizasyonu , kristal temaslarla stabilize edilmiş düzenli bir dizi bireysel protein molekülünün oluşum sürecidir. Eğer kristal yeterince düzenli ise kırınım yapacaktır . Bazı proteinler , göz merceğindeki aquaporin gibi doğal olarak kristal diziler oluşturur .

Protein kristalizasyonu sürecinde, proteinler sulu bir ortamda çözündürülür ve aşırı doymuş duruma ulaşana kadar numune solüsyonu verilir . Bu duruma ulaşmak için buhar difüzyonu, mikrobatch, mikrodiyaliz ve serbest arayüzlü difüzyon gibi farklı yöntemler kullanılır. Protein kristalleri geliştirmek, pH, sıcaklık, kristalizasyon çözeltisindeki iyonik kuvvet ve hatta yerçekimi gibi birçok faktörden etkilenen zor bir süreçtir. Bir kez oluşturulduktan sonra, bu kristaller , özellikle çeşitli endüstriyel veya tıbbi amaçlar için proteinin moleküler yapısını incelemek için yapısal biyolojide kullanılabilir.

Protein kristalizasyonunun gelişimi

150 yılı aşkın bir süredir bilim adamları, protein moleküllerinin kristalleşmesini biliyorlar.

1840'ta Friedrich Ludwig Hünefeld, iki cam slayt altında tutulan solucan kanı örneklerinde kristalin materyal oluşumunu tesadüfen keşfetti ve bazen kurutulmuş domuz veya insan kanı örneklerinde küçük plaka benzeri kristaller gözlemledi. Bu kristallere 1864 yılında Felix Hoppe-Seyler tarafından 'hemoglobin' adı verildi. Hünefeld'in ufuk açıcı bulguları gelecekte birçok bilim insanına ilham kaynağı oldu.

1851'de Otto Funke, kırmızı kan hücrelerinin saf su, alkol veya eter gibi çözücülerle seyreltilmesi ve ardından çözücünün protein çözeltisinden yavaş buharlaştırılması yoluyla insan hemoglobin kristalleri üretme sürecini tanımladı. 1871'de Jena Üniversitesi'nden Profesör William T. Preyer, yaklaşık 50 memeli, kuş, sürüngen ve balık türünden hemoglobin kristallerinin özelliklerini inceleyen Die Blutkrystalle (Kan Kristalleri) adlı bir kitap yayınladı .

1909'da fizyolog Edward T. Reichert, mineralog Amos P. Brown ile birlikte, Tazmanya kurdu gibi soyu tükenmiş türler de dahil olmak üzere yüzlerce hayvandan hemoglobin kristallerinin hazırlanması, fizyolojisi ve geometrik karakterizasyonu hakkında bir inceleme yayınladı. Artan protein kristalleri bulundu.

1934'te John Desmond Bernal ve öğrencisi Dorothy Hodgkin , ana sıvılarıyla çevrili protein kristallerinin, kurutulmuş kristallerden daha iyi kırınım desenleri verdiğini keşfettiler. Pepsin kullanarak , ıslak, küresel bir proteinin kırınım modelini ilk fark eden onlardı. Bernal ve Hodgkin'den önce, protein kristalografisi sadece kuru koşullarda, tutarsız ve güvenilmez sonuçlarla gerçekleştirilmişti. Bu, bir protein kristalinin ilk X-ışını kırınım modelidir.

1958'de, X-ışını kristalografisi ile belirlenen miyoglobinin (hem içeren kırmızı bir protein) yapısı ilk olarak John Kendrew tarafından rapor edildi . Kendrew , bu keşif için 1962 Nobel Kimya Ödülü'nü Max Perutz ile paylaştı .

Şimdi, protein kristallerine dayanarak, bunların yapıları biyokimya ve translasyonel tıpta önemli bir rol oynamaktadır.

Protein kristalizasyonunun temelleri

Polarize filtreden gözlemlenen lizozim kristalleri.

Protein kristalizasyonu teorisi

Kristal oluşumunun esası, numune çözeltisinin aşırı doygun duruma ulaşmasına izin vermektir. Aşırı doygunluk, McPherson ve ark. 2014, “belirli kimyasal ve fiziksel koşullar altında, çözünürlük sınırını aşan bir miktar makromolekülün yine de çözeltide mevcut olduğu bir denge dışı durum” olarak tanımlanmıştır. Agregasyon ve kristaller gibi çözeltide katıların oluşumu, dengenin yeniden kurulmasını kolaylaştırır. Sistem, enerji ifadesindeki her bileşenin minimumda olması için dengeyi yeniden kurmak ister. Enerji ifadesinde entalpi (∆H), entropi (∆S) ve sıcaklık (T) olmak üzere üç ana faktör vardır. Bu ifadedeki ∆H, reaksiyonlar veya faz değişiklikleri üzerine oluşan ve kırılan kimyasal bağların ∆H'si ile ilgilidir. ∆S, moleküllerin sahip olabileceği serbestlik derecesi veya belirsizlik ölçümü ile ilgilidir. Bir sürecin kendiliğindenliği, Gibb'in serbest enerjisi (∆G), ∆G = ∆H- T∆S olarak tanımlanır. Bu nedenle, ∆S'nin artması veya ∆H'nin azalması, genel sürecin kendiliğindenliğine katkıda bulunur, ∆G'yi daha negatif hale getirir, böylece sistemin minimum enerji durumuna ulaşır. Kristaller oluştuğunda, protein molekülleri daha düzenli hale gelir, bu da ∆S'de bir azalmaya yol açar ve ∆G'yi daha pozitif hale getirir. Bu nedenle, kendiliğinden kristalleşme, daha düzenli sistemden entropi kaybının üstesinden gelmek için yeterince negatif bir ∆H gerektirir.

Çözeltiden kristale giden moleküler bir bakış

Kristal oluşumu iki adım gerektirir: çekirdeklenme ve büyüme. Çekirdeklenme, kristalleşmenin başlama aşamasıdır. Çekirdeklenme aşamasında, çözeltideki protein molekülleri, kararlı bir katı çekirdek oluşturmak için kümeler halinde bir araya gelir. Çekirdek oluşurken, kristal bu kararlı çekirdeğe bağlanan moleküller tarafından daha da büyür. Çekirdeklenme aşaması kristal oluşumu için kritiktir, çünkü numunelerin yüksek derecede serbestlikten düzenli bir duruma (suludan katıya) geçiş yapan birinci dereceden faz geçişidir. Çekirdeklenme adımının başarılı olması için kristalizasyon parametrelerinin manipülasyonu esastır. Bir proteinin kristalleşmesinin arkasındaki yaklaşım, hedeflenen proteinin çözelti içinde daha düşük bir çözünürlüğünü sağlamaktır. Çözünürlük sınırı aşıldığında ve kristaller mevcut olduğunda, kristalizasyon gerçekleştirilir.

Protein kristalizasyon yöntemleri

buhar difüzyonu

Kristalleri hazırlamanın üç yöntemi, A: Asılı damla. B: Oturarak düşme. C: Mikrodiyaliz

Buhar difüzyonu, protein kristalizasyonunun en yaygın olarak kullanılan yöntemidir. Bu yöntemde, saflaştırılmış protein, tampon ve çökeltici içeren damlacıkların, daha yüksek konsantrasyonlarda benzer tamponlar ve çökelticiler içeren daha büyük bir rezervuar ile dengelenmesine izin verilir. Başlangıçta, protein çözeltisi damlacığı nispeten düşük çökeltici ve protein konsantrasyonları içerir, ancak damla ve rezervuar dengelendiğinde, damladaki çökeltici ve protein konsantrasyonları artar. Belirli bir protein için uygun kristalizasyon çözeltileri kullanılırsa, damlada kristal büyümesi meydana gelir. Bu yöntem, büyük ve iyi düzenlenmiş kristallerin büyümesine yardımcı olan protein konsantrasyonunda ve çökeltici konsantrasyonunda nazik ve kademeli değişikliklere izin verdiği için kullanılır.

Buhar difüzyonu asarak-bırak veya oturarak-damla formatında gerçekleştirilebilir. Asma-damla aparatı, ters çevrilmiş bir lamel üzerine yerleştirilen ve daha sonra rezervuarın üzerinde süspanse edilen bir damla protein solüsyonunu içerir. Oturarak-damla kristalizasyon aparatı, damlayı hazneden ayrılmış bir kaide üzerine yerleştirir. Bu yöntemlerin her ikisi de damla ve rezervuar arasında dengenin oluşabilmesi için ortamın sızdırmazlığını gerektirir.

mikro parti

Bir mikro parti genellikle çok küçük hacimli protein damlacıklarının yağa (1 µl kadar az) daldırılmasını içerir. Yağın gerekli olmasının nedeni, bu kadar düşük hacimli protein çözeltisinin kullanılması ve bu nedenle deneyi sulu olarak gerçekleştirmek için buharlaşmanın engellenmesi gerektiğidir. Kullanılabilecek çeşitli yağlar olmasına rağmen, en yaygın iki sızdırmazlık maddesi parafin yağları (Chayen ve diğerleri tarafından açıklanmıştır) ve silikon yağlarıdır (D'Arcy tarafından açıklanmıştır). Sıvı bir sızdırmazlık maddesi kullanmayan ve bunun yerine bir bilim insanının damlayı kuyuya yerleştirdikten sonra bir film veya bir miktar bandı hızlı bir şekilde çukurlu bir plaka üzerine yerleştirmesini gerektiren başka Mikro yığınlama yöntemleri de vardır.

İhtiyaç duyulan çok sınırlı miktarda numunenin yanı sıra, bu yöntemin başka bir avantajı da numunelerin deney sırasında asla havaya maruz kalmadıkları için hava kaynaklı kontaminasyondan korunmasıdır.

mikrodiyaliz

Mikrodiyaliz, küçük moleküllerin ve iyonların geçebildiği, proteinlerin ve büyük polimerlerin geçemediği yarı geçirgen bir zardan yararlanır. Membran boyunca bir çözünen konsantrasyonu gradyanı oluşturarak ve sistemin dengeye doğru ilerlemesine izin vererek, sistem yavaş yavaş aşırı doygunluğa doğru hareket edebilir, bu noktada protein kristalleri oluşabilir.

Mikrodiyaliz, yüksek konsantrasyonlarda tuz veya proteinin çözünürlüğünü azaltan diğer küçük zar geçirgen bileşikler kullanılarak tuzlanarak kristaller üretebilir. Çok nadiren, bazı proteinler diyaliz tuzlama, saf suya karşı diyaliz, çözünen maddelerin uzaklaştırılması, kendi kendine birleşme ve kristalleşme ile kristalize edilebilir.

Serbest arayüz difüzyonu

Bu teknik, protein ve çökeltme çözeltilerini önceden karıştırmadan bir araya getirir, bunun yerine bunları bir kanalın her iki tarafından enjekte ederek difüzyon yoluyla dengeye izin verir. İki çözelti, bir reaktif bölmesinde, her ikisi de maksimum konsantrasyonlarında temas ederek kendiliğinden çekirdeklenmeyi başlatır. Sistem dengeye geldiğinde, aşırı doygunluk seviyesi düşer ve kristal büyümesini destekler.

Protein kristalleşmesini etkileyen faktörler

pH

Protein kristalizasyonu için temel itici güç, moleküller arası etkileşimler yoluyla birinin başka bir proteinle oluşturabileceği bağların sayısını optimize etmektir. Bu etkileşimler, moleküllerin elektron yoğunluklarına ve pH'ın bir fonksiyonu olarak değişen protein yan zincirlerine bağlıdır. Proteinlerin üçüncül ve dördüncül yapısı, amino asitlerin yan grupları arasındaki moleküller arası etkileşimler tarafından belirlenir; buradaki hidrofilik gruplar, çözücüye (su) bir hidrasyon kabuğu oluşturmak için genellikle çözeltiye bakar. pH değiştikçe, bu polar yan grup üzerindeki yük de çözelti pH'ına ve proteinin pKa'sına göre değişir. Bu nedenle, pH seçimi, moleküller arasındaki bağın su moleküllerinden daha uygun olduğu durumlarda kristal oluşumunu teşvik etmek için esastır. pH, optimal kristalizasyon koşulu için atanabilecek en güçlü manipülasyonlardan biridir.

Sıcaklık

Protein çözünürlüğü sıcaklığın bir fonksiyonu olduğundan sıcaklık, tartışılması gereken bir başka ilginç parametredir. Protein kristalizasyonunda, başarılı kristaller elde etmek için sıcaklığın manipülasyonu yaygın bir stratejidir. pH'dan farklı olarak, kristalografi deneylerinin farklı bileşenlerinin sıcaklığı, tampon hazırlama sıcaklığı, gerçek kristalizasyon deneyinin sıcaklığı vb. gibi nihai sonuçları etkileyebilir.

Kimyasal katkı maddeleri

Kimyasal katkı maddeleri, kristal verimini artırmak için kristalizasyon işlemine eklenen küçük kimyasal bileşiklerdir. Küçük moleküllerin protein kristalizasyonundaki rolü, çoğu durumda kirletici olarak düşünüldükleri için ilk günlerde iyi düşünülmemişti. Daha küçük moleküller, proteinler gibi makromoleküllerden daha iyi kristalleşir, bu nedenle, McPherson tarafından yapılan çalışmadan önce kimyasal katkı maddelerinin kullanımı sınırlıydı. Ancak bu, biyokimyacılar ve kristalografların daha fazla araştırmaları ve uygulamaları için önemli olan kristalizasyon için deneysel parametrelerin güçlü bir yönüdür.

Protein kristalizasyonuna yardımcı olan teknolojiler

Yüksek verimli kristalizasyon taraması

Başarılı kristal büyümesi için gerekli olan çeşitli koşulları araştırmak için gereken çok sayıda deneyi düzene sokmaya yardımcı olmak için yüksek verimli yöntemler mevcuttur. Başarılı kristalizasyon üretmesi garanti edilen sistemlerde önceden birleştirilmiş bileşenleri uygulayan sipariş için çok sayıda ticari kit bulunmaktadır. Bir bilim adamı böyle bir kiti kullanarak, bir proteini saflaştırma ve uygun kristalizasyon koşullarını belirleme zahmetinden kurtulur.

Sıvı işleme robotları , aynı anda çok sayıda kristalizasyon deneyi kurmak ve otomatikleştirmek için kullanılabilir. Bir insan tarafından gerçekleştirilen aksi takdirde yavaş ve potansiyel olarak hataya açık olan süreç, otomatik bir sistemle verimli ve doğru bir şekilde gerçekleştirilebilir. Robotik kristalizasyon sistemleri, yukarıda açıklanan aynı bileşenleri kullanır, ancak prosedürün her adımını hızlı ve çok sayıda kopya ile gerçekleştirir. Her deney küçük miktarlarda solüsyon kullanır ve daha küçük boyutun avantajı iki katıdır: daha küçük numune boyutları yalnızca saflaştırılmış protein harcamasını azaltmakla kalmaz, aynı zamanda daha küçük miktarlarda solüsyon daha hızlı kristalleşmelere yol açar. Her deney, kristal büyümesini tespit eden bir kamera tarafından izlenir.

Protein mühendisliği

Proteinler, Yüzey Entropi Azaltma veya kristal temaslarda mühendislik gibi teknikler kullanılarak başarılı protein kristalizasyonu şansını artırmak için tasarlanabilir. Sıklıkla, problemli sistein kalıntıları, disülfid aracılı kümelenmeyi önlemek için alanin ile değiştirilebilir ve lizin, glutamat ve glutamin gibi kalıntılar, kristalleşmeyi engelleyebilen içsel protein esnekliğini azaltmak için alanine dönüştürülebilir.

Protein kristalografisinin uygulamaları

Makromoleküler yapılar, X-Işını Kırınım / X-ışını kristalografisi , Kriyojenik Elektron Mikroskobu (CryoEM) ( Elektron Kristallografisi ve Mikrokristal Elektron Kırınım (MicroED) dahil ), Küçük açılı X-ışını dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak protein kristalinden belirlenebilir. saçılma ve Nötron kırınımı . Ayrıca bkz . Yapısal biyoloji .

Proteinlerin kristalizasyonu, farmasötik amaçlar için proteinlerin formülasyonunda da faydalı olabilir.

Ayrıca bakınız

Referanslar

Dış bağlantılar