Nükleik asit testi - Nucleic acid test
Bir nükleik asit, bir test ( NAT ) belirli bir tespit etmek için kullanılan bir tekniktir nükleik asit dizisini ve bu nedenle genellikle tespit etmek ve organizmanın belirli bir türü ya da alt türü, genellikle tespit etmek virüs ya da bakteri gibi davranan bir bir patojen olarak kan , doku , idrar , vb. NAT'lar , antijenler veya antikorlar yerine genetik materyalleri ( RNA veya DNA ) tespit etmeleri bakımından diğer testlerden farklıdır . Genetik materyallerin tespiti, bir hastalığın erken teşhisine izin verir, çünkü antijenlerin ve/veya antikorların tespiti, kan dolaşımında görünmeye başlamaları için zaman gerektirir. Belirli bir genetik materyalin miktarı genellikle çok küçük olduğundan, birçok NAT, genetik materyali çoğaltan, yani onun birçok kopyasını oluşturan bir adım içerir. Bu tür NAT'lara nükleik asit amplifikasyon testleri ( NAAT'ler ) denir . Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), iplik yer değiştirme deneyi (SDA) veya transkripsiyon aracılı deney (TMA) dahil olmak üzere birkaç amplifikasyon yolu vardır .
Hemen hemen tüm nükleik asit amplifikasyon yöntemleri ve saptama teknolojileri Watson-Crick baz eşleşmesinin özgüllüğünü kullanır ; tek iplikli prob veya primer moleküller, tamamlayıcı ipliklerin DNA veya RNA hedef moleküllerini yakalar . Bu nedenle, prob şeritlerinin tasarımı , algılamanın duyarlılığını ve özgüllüğünü artırmak için oldukça önemlidir . Bununla birlikte, çeşitli insan hastalıklarının genetik temelini oluşturan mutantlar , genellikle normal nükleik asitlerden biraz farklıdır. Çoğu zaman, yalnızca tek bir bazda farklıdırlar, örneğin, eklemeler , delesyonlar ve tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler). Bu durumda, bağlanma kusurlu prob-hedef kolayca elde oluşabilir yanlış pozitif bir mistaking gibi sonuçlar suşu olan ortakçı patojenik biri için. Tek-baz özgüllüğü elde etmek için birçok araştırma yapılmıştır.
ilerlemeler
Karşılık gelen dizilere sahip nükleik asit (DNA ve RNA) iplikleri, bir çamaşır kurutma makinesinde yuvarlanan Velcro gibi, çift zincirler halinde birbirine yapışır. Ancak zincirin her bir düğümü çok yapışkan değildir, bu nedenle çift sarmallı zincir sürekli olarak kısmen açılmamış olarak gelir ve ortam titreşimlerinin etkisi altında kendini yeniden sıkıştırır (termal gürültü veya Brownian hareketi olarak adlandırılır ). Daha uzun eşleştirmeler daha kararlıdır. Nükleik asit testleri, üzerine kısa bir iplik yapıştırılmış uzun bir iplik olan bir "sonda" kullanır. Uzun primer dizisi, saptanan hastalık organizmasından bir "hedef" diziye karşılık gelen (tamamlayıcı) bir diziye sahiptir. Hastalık sarmalı, uzun primer sarmalın ("toehold" olarak adlandırılır) açıkta kalan kısmına sıkıca yapışır ve ardından yavaş yavaş, kısa "koruyucu" ipliği sondadan uzaklaştırır. Sonunda, kısa koruyucu şerit hiçbir şeye bağlı değildir ve bağlanmamış kısa astar saptanabilir. Bu bölümün geri kalanı, bu süreci yararlı bir teste dönüştürmek için gereken araştırmaların bazı tarihçesini vermektedir.
2012 yılında, Yin'in araştırma grubu, nükleik asit hibridizasyonunun özgüllüğünü optimize etme hakkında bir makale yayınladı. Önceden melezleştirilmiş bir tamamlayıcı iplik C ve bir koruyucu iplik P'den oluşan bir 'toehold değişim probu (PC)' tanıttılar. Tamamlayıcı, hedef diziyle mükemmel bir şekilde tamamlayıcıdır. Doğru hedef(X), toehold değişim probu(PC) ile reaksiyona girdiğinde, P serbest bırakılır ve hibritleştirilmiş ürün XC oluşur. Reaksiyonun standart serbest enerjisi(∆) sıfıra yakındır. Öte yandan, eğer ayak değişim probu (PC) sahte hedef(S) ile reaksiyona girerse, reaksiyon ilerler, ancak standart serbest enerji termodinamik olarak daha az elverişli olacak şekilde artar. Standart serbest enerji farkı(∆∆), verimde bariz bir ayrım sağlamak için yeterince önemlidir. Ayırt etme faktörü Q, doğru hedef hibridizasyon veriminin, sahte hedef hibridizasyon verimine bölünmesiyle hesaplanır. Yin'in grubu, enerjik olarak temsili tek-baz değişiklikleri (yer değiştirmeler, silmeler ve yerleştirmeler) ile 5 doğru hedef ve 55 sahte hedef ile farklı ayak değiştirme probları üzerinde yapılan deneyler yoluyla, bu probların ayrım faktörlerinin medyan ile 3 ile 100 + arasında olduğu sonucuna varmıştır. 26. Problar, 10 °C ila 37 °C, 1 mM ila 47 mM ve 1 nM ila 5 M arasındaki nükleik asit konsantrasyonları ile sağlam bir şekilde çalışır. Ayrıca, ayak değişim problarının RNA tespitinde bile sağlam bir şekilde çalıştığını anladılar.
Daha sonraki araştırmalar daha sonra incelenmiştir. 2013 yılında, Seelig'in grubu, aynı zamanda toehold değişim reaksiyonunu da kullanan floresan moleküler problar hakkında bir makale yayınladı. Bu, doğru hedefin ve SNP hedefinin optik olarak algılanmasını sağladı. Ayrıca E. coli'den türetilmiş numunelerde SNP'lerin saptanmasında da başarılı oldular.
2015'te David'in grubu, 'rekabetçi bileşimler' adı verilen sistemi tanıtarak tek nükleotid varyantlarının (SNV'ler) son derece yüksek (1.000+) seçiciliğine ulaştı. Bu sistemde, SNV ve vahşi tip (WT) dizilerine, prob ve lavabonun tasarım mimarisine ve reaktife göre değişen optimal parametre değerlerini tahmin etmek için altta yatan hibridizasyon süreçlerinin kinetik bir reaksiyon modelini oluşturdular. konsantrasyonlar ve tahlil koşulları. Modelleri, önceki hibridizasyona dayalı analizlere göre en az 30 kat bir gelişmeyi temsil eden, minimum 200 ile, 44 kanserle ilişkili DNA SNV'si için medyan 890-fild seçicilikte başarılı oldu. Ek olarak, bu teknolojiyi, PCR'yi takiben insan genomik DNA'sından düşük VAF dizilerini ve ayrıca doğrudan sentetik RNA dizilerini test etmek için uyguladılar.
Uzmanlığa dayanarak, Blocker Displacement Amplification (BDA) adı verilen yeni bir PCR yöntemi geliştirdiler. Yaklaşık 20 nt'lik bir pencere içindeki tüm dizi varyantlarını vahşi tip dizilere göre 1000 kat seçici olarak yükselten, sıcaklığa dayanıklı bir PCR'dir ve orijinal olarak ≤ %0,1 alel frekansında yüzlerce potansiyel varyantının kolay saptanmasına ve nicelenmesine olanak tanır. BDA, 56 °C ila 64 °C arasında değişen tavlama sıcaklıklarında benzer zenginleştirme performansı elde eder. Bu sıcaklık sağlamlığı, genom boyunca birçok farklı varyantın çoklu zenginleştirilmesini kolaylaştırır ve ayrıca, nadir DNA varyant tespiti için pahalı olmayan ve taşınabilir ısıl döngü araçlarının kullanılmasını sağlar. BDA, akciğer kanseri hastalarının kan plazmasından toplanan klinik hücresiz DNA örnekleri de dahil olmak üzere numune türlerinde bile doğrulanmıştır.
Uygulamalar
- Gonokokal ve diğer Neisserial enfeksiyonların teşhisi: Tespit için spesifik N. gonore DNA veya RNA dizilerinin amplifikasyonu.
- Ürogenital C. trachomatis enfeksiyonlarının teşhisi
- Mycobacterium tuberculosis Tespiti
- HIV RNA veya DNA tespiti
- Zoonotik koronavirüslerin tespiti
- SARS-CoV-2 için tanı testi