N-asil fosfatidiletanolamin-spesifik fosfolipaz D - N-acyl phosphatidylethanolamine-specific phospholipase D

N-asil fosfatidiletanolamin fosfolipaz D
tanımlayıcılar
Sembol NAPEPLD
NCBI geni 222236
HGNC 21683
OMIM 612334
PDB 4QN9
Referans Sırası NM_001122838
UniProt Q6IQ20
Diğer veri
EC numarası 3.1.4.54
yer Chr. 7 q22.1

N-asil fosfatidiletanolamin fosfolipaz D ( NAPE-PLD ), N-asil-fosfatidiletanolamin'den (NAPE) N-asiletanolamin (NAE) salınımını katalize eden bir enzimdir . Bu, sıradan lipidleri anandamid ve oleoiletanolamin gibi kimyasal sinyallere dönüştüren sürecin önemli bir parçasıdır . İnsanlarda, NAPE-PLD proteini, NAPEPLD geni tarafından kodlanır .

keşif

NAPE-FLD bir bir enzim , bir - aktivite fosfolipaz üzerine etki eden, fosfolipidler bulunan hücre zan . Onu fosfolipaz D olarak sınıflandıran homoloji değil, aktivitesinin kimyasal sonucudur . Enzimatik aktivite, peptit sekanslamanın gerçekleştirilebileceği bir biyokimyasal saflaştırma şemasının 2004 yayınında doruğa ulaşan bir dizi deneyde keşfedildi ve karakterize edildi . Araştırmacılar homojenize 150 sıçan kalpleri (ince öğütülmüş) ve elde edilen tabi ham lizat için sükroz sedimantasyon hücrenin geri kalan hücre zarlarını ayırmak için 105.000 x g'de. İntegral zar proteinleri daha sonra edildi çözünür kullanılarak oktil glikozit ve dört tabi kolon kromatografisi adımları (HiTrap SP HP katyon değiştirme kolonu, HiTrap Q anyon değiştirme kolonu, HiTrap afinite kolonu Mavi, Bio-Gel HTP hidroksiapatit kolonu). Bunların her biri, proteinler zaman içinde kolondan ayrıştırıldığında farklı tipteki membran proteinlerini farklı numune kaplarına ayırır ve her kaptaki numunelerin aktivitesini ölçerek, aktif enzimi hangilerinin aldığını izlemek mümkün olmuştur. Enzim aktivitesinin ölçümü , NAPE-PLD enzimatik aktivitesine duyarlı bir radyoaktif substratın ince tabaka kromatografisi ile yapıldı : Radyasyon bir biyo-görüntüleme analiz cihazında tespit edildiğinde plaka üzerinde göründüğü yerden etkilenen substratın bölünmesi.

Bu kapsamlı prosedürün sonucu hala saf bir protein değildi, ancak SDS-PAGE ile sınırlı sayıda bant üretti ve 46 kilodaltonluk bir bandın yoğunluk olarak enzimatik aktivite ile korelasyon gösterdiği bulundu. Bu bant jelden çıkarıldı ve tripsin ile sindirildi ve ondan gelen peptitler, ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile birbirinden ayrıldı . Ortaya çıkan fragmanlar daha sonra otomatik bir Edman bozunması ile mikro-sıralandı . Üçü , kirletici olduğuna inanılan 56 kDa'lık bir ara filament proteini olan vimentine karşılık geldi ve diğer ikisi, daha sonra NAPE-PLD olarak tanımlanan cDNA klonuyla eşleşti.

Bu ipucu elde edildikten sonra, tanımlama daha az zahmetli bir prosedürle doğrulanabilir: Varsayılan NAPE-PLD cDNA'nın COS-7 hücrelerinde aşırı ekspresyonu , özellikleri benzer olduğu gösterilen güçlü bir NAPE-PLD enzimatik aktivitesi verdi. orijinal kalp özü.

özellikleri

NAPEPLD cDNA dizisi 396 tahmin amino asit % 89 ve insanlarınkine% 90'dan fazla özdeş olan fareler ve sıçanlarda dizileri. NAPE-PLD'nin bilinen fosfolipaz D genleri ile homolojiye sahip olmadığı bulundu , ancak homolojiye göre beta-laktamaz katının çinko metallohidrolaz ailesine girmek üzere sınıflandırılabilir . Özellikle, yüksek oranda korunmuş motif H X( E / H )X D ( C / R / S / H )X 50–70 H X 15–30 ( C / S / D )X 30–70 H gözlemlendi, ki bu genel olarak, bu protein sınıfında çinko bağlama ve hidroliz reaksiyonu ile ilişkilidir ve yazarların aktivitenin çinko içeriği ile ilişkilendirilmesi gerektiğini önermelerine yol açar.

Tüm rekombinant NAPE-FLD COS hücrelerinde test edildi vitro birkaç karşı benzer aktiviteye sahip radyo-etiketli N- palmitoylphosphatidylethanolamine, N-arachidonoylphosphatidylethanolamine, N-oleoylphosphatidylethanolamine ve N-stearoylphosphatidylethanolamine tüm ile reaksiyona: yüzeylerde K m , 2-4 arasında mikromolar ve a V max 73 ve 101 arasında nanomol başına miligram tarafından hesaplanan dakika başına Lineweaver-Burk grafiğine . (Bu N üretmek palmitoylethanolamine , anandamid , N oleoiletanolamin sırasıyla, ve N-stearoylethanolamine) enzim Benzer K ile N-palmitoil-lizo-fosfatidiletanolamin ve N-arakidonoil-lizo-fosfatidiletanolamin reaksiyona sokularak m ama birine az üçte -dördüncü V max . Bu aktiviteler, birçok dokunun bir dizi N- asiletanolamin ürettiği gözlemiyle tutarlıdır .

Bununla birlikte, NAPE-PLD tespit üretmek için bir yeteneğine sahip fosfatidik asit gelen fosfatidilkolin veya fosfatidiletanolamin diğer tarafından katalize edilir olarak fosfolipaz D enzimler. Aynı zamanda, etanol veya bütanol varlığında fosfatidik asit yerine fosfatidil alkollerin oluşturulmasına izin veren fosfolipaz D'nin transfosfatidilasyon aktivitesinden de yoksundur .

Patika

Bu enzim , bir açil grubunun gliserofosfolipidin sn- 1 pozisyonundan fosfatidiletanolamin amino grubuna transferi yoluyla N-asilfosfatidiletanolamin yaratılmasıyla başlatılan biyokimyasal yolun ikinci adımı olarak görev yapar . NAPE-PLD, memeli merkezi sinir sisteminde birkaç NAE'nin biyosentezine katkıda bulunurken , bu enzimin endokannabinoid anandamidin oluşumundan sorumlu olup olmadığı açık değildir , çünkü NAPE-PLD nakavt farelerin vahşi tipte olduğu rapor edilmiştir. seviyeleri veya çok düşük seviyelerde anandamid.

N-acylethanolamines bu enzim tarafından piyasaya için potansiyel alt-tabakalar olmak yağlı asit amid hidrolaz (FAAH), hidrolize serbest yağ asitleri arasından etanolamin . Bu enzimdeki kusurlar, anandamid gibi NAPE-PLD ürünlerinin normal olarak gözlemlenenden 15 kat daha yüksek seviyelere çıkmasına neden olabilir.

Yapı

Bu membran enzimi , kısmen iç ∼9-Å genişliğinde bir kanalla ayrılmış homodimerler oluşturur . Metallo beta-laktamaz protein kıvrımı, membran fosfolipidleri ile birleşmek üzere uyarlanmıştır . Hidrofobik bir boşluk, NAPE substratı için, iki çekirdekli bir çinko merkezinin hidrolizini katalize ettiği aktif bölgeye bir giriş yolu sağlar . Safra asitleri , bu boşluktaki seçici ceplere yüksek afinite ile bağlanır, dimer düzeneğini arttırır ve katalizi mümkün kılar. NAPE-PLD, safra asidi sinyalleri ile lipid amid sinyalleri arasındaki karışmayı kolaylaştırır .

Referanslar