Mikro ölçekli termoforez - Microscale thermophoresis

MST Teknolojisinin Prensibi: MST, serbest çözelti içinde ince kılcal damarlarda gerçekleştirilir, böylece doğala yakın koşullar (herhangi bir tamponda, hatta karmaşık biyosıvılarda bile hareketsiz hale getirilmez) ve bakım gerektirmeyen bir alet sağlar. Bir MST deneyi gerçekleştirirken, bir kızılötesi lazer tarafından mikroskobik bir sıcaklık gradyanı indüklenir ve TRIC ile termoforez saptanır. TRIC, bağlanma olaylarında tipik olarak değişen floroforun mikro ortamına bağlıdır. Molekülün sıcaklık gradyanındaki hareketi olan termoforez, etkileşim üzerine tipik olarak değişen üç parametreye bağlıdır. Böylece, genel MST sinyali, bağlanma afinitesinin çıkarılabileceği bir doz-yanıt eğrisi elde etmek için ligand konsantrasyonuna karşı çizilir.

Mikro ölçekli termoforez ( MST ), biyomoleküller arasındaki etkileşimlerin biyofiziksel analizi için bir teknolojidir . Mikro ölçekli termoforez , floresan olmayan bir ligandın konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak bir hedefin floresansında sıcaklığa bağlı bir değişikliğin saptanmasına dayanır. Floresansta gözlenen değişiklik iki farklı etkiye dayanmaktadır. Bir yandan, bağlanma olaylarından etkilenebilen floresan probun sıcaklığa bağlı yoğunluk değişimine (TRIC) dayanır. Öte yandan, mikroskobik bir sıcaklık gradyanında parçacıkların yönlendirilmiş hareketi olan termoforezi temel alır . Floresan probun kimyasal mikro-ortamındaki herhangi bir değişiklik ve ayrıca biyomoleküllerin hidrasyon kabuğundaki değişiklikler, bir sıcaklık gradyanı uygulandığında tespit edilen floresansın nispi bir değişikliği ile sonuçlanır ve bağlanma afinitelerini belirlemek için kullanılabilir . MST, bir yüzeye immobilizasyona gerek kalmadan (hareketsizleştirme gerektirmeyen teknoloji) doğrudan çözeltideki etkileşimlerin ölçülmesine olanak tanır.

Uygulamalar

yakınlık

stokiyometri

termodinamik parametreler

MST, biyomoleküler etkileşimlere entalpik ve entropik katkıları tahmin etmek için kullanılmıştır .

Ek bilgi

  • Numune özelliği (homojenlik, kümelenme, kararlılık)
  • Çoklu bağlama siteleri, işbirliği

teknoloji

MST, bir sıcaklık değişikliği uygulandığında bir numunedeki bir floresan değişikliğinin ölçülebilir tespitine dayanır. Bir hedef molekülün floresansı, dışsal veya içsel (aromatik amino asitler ) olabilir ve iki farklı etki nedeniyle sıcaklık gradyanlarında değiştirilir. Bir yandan, floroforların floresans yoğunluğunu sıcaklığın bir fonksiyonu olarak değiştirmeye yönelik içsel özelliğini tanımlayan sıcaklığa bağlı yoğunluk değişimi (TRIC) . Floresan yoğunluğundaki değişimin kapsamı, konformasyonel değişiklikler veya ligandların yakınlığı nedeniyle bağlanma olaylarında değişebilen floresan probun kimyasal ortamından etkilenir . Öte yandan MST, termoforez olarak adlandırılan bir etki olan sıcaklık gradyanları boyunca moleküllerin yönlendirilmiş hareketine de dayanır. Bir uzamsal sıcaklık farkı ΔT, Soret katsayısı S T :c sıcak /c soğuk = exp(-S T ΔT) ile nicelenen, yükseltilmiş sıcaklık bölgesindeki molekül konsantrasyonunda bir değişikliğe yol açar . Hem TRIC hem de termoforez, MST ölçümlerinde kaydedilen sinyale şu şekilde katkıda bulunur: ∂/∂T(cF)=c∂F/∂T+F∂c/∂T. Bu denklemdeki ilk terim c∂F/∂T, TRIC'yi sıcaklığın (T) bir fonksiyonu olarak floresans yoğunluğundaki (F) bir değişiklik olarak tanımlarken, ikinci terim F∂c/∂T, partikül konsantrasyonundaki değişiklik olarak termoforezi tanımlar. (c) sıcaklığın bir fonksiyonu olarak. Termoforez, molekül ve çözücü arasındaki arayüze bağlıdır. Sabit tampon koşulları altında, termoforez moleküllerin boyutunu, yükünü ve çözünme entropisini araştırır. Floresan olarak etiketlenmiş bir molekül A'nın termoforezi, boyut, yük ve solvasyon entropi farklılıkları nedeniyle tipik olarak bir molekül hedef kompleksi AT'nin termoforezinden önemli ölçüde farklıdır. Molekülün termoforezindeki bu fark, sabit tampon koşulları altında titrasyon deneylerinde bağlanmayı ölçmek için kullanılır.

Floresan olarak etiketlenmiş molekülün termoforetik hareketi, bir kapiler içindeki floresan dağılımı F izlenerek ölçülür . Mikroskobik sıcaklık gradyanı, kılcal damara odaklanan ve su tarafından güçlü bir şekilde emilen bir IR-Lazer tarafından üretilir. Lazer noktasındaki sulu çözeltinin sıcaklığı ΔT=1-10 K yükseltilir. IR-Lazer çalıştırılmadan önce kılcal damarın içinde homojen bir floresan dağılımı F soğuk gözlenir. IR-Lazer açıldığında, aynı zaman ölçeğinde iki etki meydana gelir ve yeni flüoresans dağılımına F hot katkıda bulunur . Termal gevşeme, sıcaklık sıçramasına (TRIC) yerel çevreye bağlı tepkisi nedeniyle boyanın floresansında bağlanmaya bağlı bir düşüşe neden olur. Aynı zamanda moleküller tipik olarak lokal olarak ısıtılan bölgeden dış soğuk bölgelere doğru hareket eder. Moleküllerin yerel konsantrasyonu, kararlı durum dağılımına ulaşana kadar ısıtılan bölgede azalır.

Kütle difüzyonu D, tükenme kinetiğini belirlerken, S T , bir sıcaklık artışı ΔT altında c sıcak /c soğuk =exp(-S T ΔT) ≈ 1-S T ΔT kararlı durum konsantrasyon oranını belirler . Normalleştirilmiş floresan F normu =F sıcak /F soğuk , TRIC ∂F/∂T'ye ek olarak esas olarak bu konsantrasyon oranını ölçer. Doğrusal yaklaşımda şunu buluruz: F normu =1+(∂F/∂TS T )ΔT. Floresan yoğunluğunun doğrusallığı ve termoforetik tükenme nedeniyle, bağlanmamış molekül F normundan (A) ve bağlı kompleks F normundan (AT) normalleştirilmiş floresan doğrusal olarak üst üste gelir. Hedeflere bağlı moleküllerin fraksiyonu x ile ifade edilerek, hedef T'nin titrasyonu sırasında değişen floresan sinyali şu şekilde verilir: F normu =(1-x) F normu (A)+x F normu (AT).

Kantitatif bağlanma parametreleri, bağlanma substratının bir seri seyreltmesi kullanılarak elde edilir. Seyreltme serisinin farklı konsantrasyonlarının logaritmasına karşı F normunu çizerek , sigmoidal bir bağlanma eğrisi elde edilir. Bu bağlanma eğrisi, sonuç olarak ayrışma sabiti K D ile, kütle hareketi yasasının doğrusal olmayan çözümü ile doğrudan donatılabilir .

Referanslar