Metagenomik - Metagenomics

Metagenomiks, genetik malzemeler ( DNA , Cı- ) vardır ekstre (örneğin, toprak, deniz suyu, insan bağırsak, çevreden alınan numuneler ile irtibata A ) (filtre edildikten sonra B ) ve edilmektedir dizilenmiştir ( E ile çarpıldıktan sonra) klonlama ( D ) av tüfeği dizilimi adı verilen bir yaklaşımla . Bu kısa diziler daha sonra , orijinal çevresel numuneyi oluşturan bireysel genomları veya genom parçalarını çıkarmak için birleştirme yöntemleri ( F ) kullanılarak tekrar bir araya getirilebilir . Bu bilgi daha sonra çevrenin mikrobiyal topluluğunun tür çeşitliliğini ve işlevsel potansiyelini incelemek için kullanılabilir .

Metagenomik , doğrudan çevresel örneklerden elde edilen genetik materyalin incelenmesidir . Geniş alan aynı zamanda çevresel genomik , ekogenomik veya topluluk genomiği olarak da ifade edilebilir .

Geleneksel mikrobiyoloji ve mikrobiyal genom dizilimi ve genomik , ekili klonal kültürlere dayanırken , erken çevresel gen dizilimi , doğal bir örnekte bir çeşitlilik profili üretmek için klonlanmış spesifik genleri (genellikle 16S rRNA geni) kullanır. Bu tür çalışmalar, mikrobiyal biyoçeşitliliğin büyük çoğunluğunun ekime dayalı yöntemlerle kaçırıldığını ortaya çıkardı .

Daha önce saklı olan mikroskobik yaşam çeşitliliğini ortaya çıkarma yeteneğinden dolayı metagenomik, tüm canlı dünyanın anlaşılmasında devrim yaratma potansiyeline sahip mikrobiyal dünyayı görüntülemek için güçlü bir mercek sunar. DNA dizilemenin fiyatı düşmeye devam ettikçe, metagenomik artık mikrobiyal ekolojinin eskisinden çok daha büyük ölçekte ve ayrıntılı olarak araştırılmasına izin veriyor . Son araştırmalar , örneklenen toplulukların tüm üyelerinden tüm genlerin büyük ölçüde yansız örneklerini almak için ya " av tüfeği " ya da PCR yönelimli dizilemeyi kullanır.

etimoloji

"Metagenomics" terimi ilk olarak Jo Handelsman , Jon Clardy , Robert M. Goodman , Sean F. Brady ve diğerleri tarafından kullanılmış ve ilk kez 1998'de yayınlanmıştır. çevre, tek bir genomun çalışmasına benzer bir şekilde analiz edilebilir . 2005 yılında, Kevin Chen ve Lior Pachter ( California Üniversitesi, Berkeley'deki araştırmacılar ) metagenomik'i "bireysel türlerin izolasyonuna ve laboratuar ekimine gerek kalmadan modern genomik tekniğin uygulanması" olarak tanımladılar.

Tarih

Geleneksel dizileme , bir DNA kaynağı olarak özdeş hücrelerin kültürüyle başlar . Bununla birlikte, erken metagenomik çalışmalar, birçok ortamda kültürlenemeyen ve dolayısıyla dizilenemeyen büyük mikroorganizma grupları olduğunu ortaya koymuştur . Bu erken çalışmalar , nispeten kısa, genellikle bir tür içinde korunan ve genellikle türler arasında farklı olan 16S ribozomal RNA (rRNA) dizilerine odaklandı . Bilinen herhangi bir kültürlenmiş türe ait olmayan birçok 16S rRNA dizisi bulunmuştur , bu da çok sayıda izole edilmemiş organizma olduğunu gösterir. Doğrudan ortamdan alınan bu ribozomal RNA genleri araştırmaları, yetiştirmeye dayalı yöntemlerin bir numunedeki bakteri ve arke türlerinin %1'inden daha azını bulduğunu ortaya koydu . Metagenomiklere olan ilginin çoğu, mikroorganizmaların büyük çoğunluğunun daha önce fark edilmediğini gösteren bu keşiflerden gelmektedir.

Bu alandaki erken moleküler çalışmalar , ribozomal RNA dizilerinin çeşitliliğini araştırmak için PCR kullanan Norman R. Pace ve meslektaşları tarafından yürütülmüştür . Bu çığır açan çalışmalardan elde edilen içgörüler, Pace'in 1985 gibi erken bir tarihte çevresel örneklerden DNA'yı doğrudan klonlama fikrini önermesine yol açtı. Bu , 1991'de Pace ve meslektaşları tarafından yayınlanan, çevresel bir örnekten toplu DNA'nın izole edilmesi ve klonlanmasıyla ilgili ilk rapora yol açtı. Pace, Indiana Üniversitesi Biyoloji Bölümü'ndeydi . Kayda değer çabalar, bunların PCR yanlış pozitifleri olmamasını sağladı ve keşfedilmemiş türlerden oluşan karmaşık bir topluluğun varlığını destekledi. Bu metodoloji, yüksek oranda korunmuş, protein kodlamayan genleri keşfetmekle sınırlı olmasına rağmen , çeşitliliğin kültürleme yöntemleriyle bilinenden çok daha karmaşık olduğuna dair erken mikrobiyal morfolojiye dayalı gözlemleri destekledi. Bundan kısa bir süre sonra Healy , 1995 yılında laboratuvarda kurutulmuş otlar üzerinde yetiştirilen karmaşık bir çevresel organizma kültüründen oluşturulan "zoolibraries"den fonksiyonel genlerin metagenomik izolasyonunu bildirdi. Edward DeLong , Pace laboratuvarından ayrıldıktan sonra sahada devam etti ve çalışmalarını yayınladı. Bu, grubunun deniz örneklerinden kütüphaneler inşa etmesiyle başlayarak, imza 16S dizilerine dayanan çevresel filogenilerin temellerini büyük ölçüde attı .

2002'de Mya Breitbart , Forest Rohwer ve meslektaşları, 200 litre deniz suyunun 5000'den fazla farklı virüs içerdiğini göstermek için çevresel pompalı tüfek dizilimi (aşağıya bakınız) kullandılar. Müteakip çalışmalar , insan dışkısında binden fazla viral tür ve muhtemelen birçok bakteriyofaj dahil olmak üzere , deniz tortusunun kilogramı başına bir milyon farklı virüs olduğunu gösterdi . Esasen bu çalışmalardaki tüm virüsler yeni türlerdi. 2004 yılında, Gene Tyson, Jill Banfield ve California Üniversitesi, Berkeley'deki meslektaşları ve Ortak Genom Enstitüsü , bir asit madeni drenaj sisteminden ekstrakte edilen DNA'yı sıraladı . Bu çaba , daha önce onları kültürleme girişimlerine direnen bir avuç bakteri ve arke için tam veya neredeyse tamamlanmış genomlarla sonuçlandı .

2003'ten başlayarak , İnsan Genom Projesi'nin özel olarak finanse edilen paralelinin lideri Craig Venter , dünyayı dolaşarak ve yolculuk boyunca metagenomik örnekler toplayarak Küresel Okyanus Örnekleme Seferi'ne (GOS) öncülük etti . Bu örneklerin tümü, yeni genomların (ve dolayısıyla yeni organizmaların) tanımlanabileceği umuduyla, av tüfeği dizilimi kullanılarak dizilenir. Sargasso Denizi'nde yürütülen pilot proje, daha önce hiç görülmemiş 148 bakteri türü de dahil olmak üzere yaklaşık 2000 farklı türden DNA buldu . Venter dünyanın çevresini dolaştı ve Amerika Birleşik Devletleri'nin Batı Kıyısını baştan sona keşfetti ve Baltık , Akdeniz ve Karadeniz'i keşfetmek için iki yıllık bir keşif gezisini tamamladı . Bu yolculuk sırasında toplanan metagenomik verilerin analizi, biri 'bayram veya kıtlık' gibi çevresel koşullara adapte olmuş taksonlardan oluşan, diğeri ise nispeten daha az ama daha bol ve yaygın olarak dağıtılmış, esas olarak planktonlardan oluşan taksonlardan oluşan iki organizma grubunu ortaya çıkardı .

2005'te Penn State Üniversitesi'nden Stephan C. Schuster ve meslektaşları, yüksek verimli dizileme ile oluşturulan bir çevresel örneğin ilk dizilerini yayınladılar, bu durumda 454 Life Sciences tarafından geliştirilen büyük ölçüde paralel piro dizileme . Bu alandaki bir başka erken makale, 2006'da Robert Edwards, Forest Rohwer ve San Diego Eyalet Üniversitesi'ndeki meslektaşları tarafından yayınlandı .

sıralama

Tipik bir metagenom projesinin akış şeması

Daha uzun bir kaç bin daha DNA dizilerinin geri kazanımı baz çifti çevre gelen numuneler son gelişmeler kadar çok zordu , moleküler biyoloji teknikleri yapımına izin kütüphaneleri de bakteriyel suni kromozomlar daha mesafede (BAC), vektörler için moleküler klonlama .

av tüfeği metagenomik

Biyoinformatikteki ilerlemeler , DNA amplifikasyonunun iyileştirilmesi ve hesaplama gücünün çoğalması, çevresel örneklerden elde edilen DNA dizilerinin analizine büyük ölçüde yardımcı oldu ve pompalı tüfek dizilemesinin metagenomik örneklere (aynı zamanda tam metagenom av tüfeği veya WMGS dizilimi olarak da bilinir) uyarlanmasına izin verdi . Birçok kültürlenmiş mikroorganizmayı ve insan genomunu dizilemek için kullanılan yaklaşım, DNA'yı rastgele keser, birçok kısa diziyi diziler ve bunları bir konsensüs dizisi halinde yeniden yapılandırır . Av tüfeği dizilimi, çevresel örneklerde bulunan genleri ortaya çıkarır. Tarihsel olarak, bu sıralamayı kolaylaştırmak için klon kitaplıkları kullanıldı. Bununla birlikte, yüksek verimli dizileme teknolojilerindeki gelişmelerle, klonlama aşaması artık gerekli değildir ve bu yoğun emek gerektiren darboğaz aşaması olmadan daha yüksek dizileme verileri verimi elde edilebilir. Shotgun metagenomik, hem hangi organizmaların mevcut olduğu hem de toplulukta hangi metabolik süreçlerin mümkün olduğu hakkında bilgi sağlar. Bir ortamdan DNA toplanması büyük ölçüde kontrolsüz olduğu için, bir çevresel örnekte en bol bulunan organizmalar, elde edilen dizi verilerinde en yüksek oranda temsil edilir. Yeterince temsil edilmeyen topluluk üyelerinin genomlarını tam olarak çözmek için gereken yüksek kapsamı elde etmek için, genellikle yasaklayıcı bir şekilde büyük örneklere ihtiyaç vardır. Öte yandan, av tüfeği dizilemesinin rastgele doğası, aksi takdirde geleneksel kültür teknikleri kullanılarak fark edilmeyecek olan bu organizmaların çoğunun, en azından bazı küçük dizi parçalarıyla temsil edilmesini sağlar.

Yüksek verimli sıralama

Yüksek verimli dizilemenin bir avantajı, bu tekniğin dizilemeden önce DNA'nın klonlanmasını gerektirmemesi, çevresel örneklemedeki ana önyargılardan ve darboğazlardan birinin ortadan kaldırılmasıdır. Yüksek verimli dizileme kullanılarak yürütülen ilk metagenomik çalışmalar, büyük ölçüde paralel 454 pyrosequencing kullandı . Çevresel örneklemeye yaygın olarak uygulanan diğer üç teknoloji, Ion Torrent Kişisel Genom Makinesi , Illumina MiSeq veya HiSeq ve Applied Biosystems SOLiD sistemidir. DNA dizileme için bu teknikler, Sanger dizilemesinden daha kısa parçalar üretir ; Ion Torrent PGM Sistemi ve 454 pyrosequencing tipik olarak ~400 bp okumalar üretir, Illumina MiSeq 400-700bp okumalar üretir (eşleştirilmiş uç seçeneklerinin kullanılıp kullanılmadığına bağlı olarak) ve SOLiD 25-75 bp okumalar üretir. Tarihsel olarak, bu okuma uzunlukları, ~750 bp'lik tipik Sanger dizileme okuma uzunluğundan önemli ölçüde daha kısaydı, ancak Illumina teknolojisi hızla bu kritere yaklaşıyor. Bununla birlikte, bu sınırlama, çok daha fazla sayıda dizi okumasıyla telafi edilir. 2009'da pyrosequenced metagenomlar 200-500 megabaz üretir ve Illumina platformları yaklaşık 20-50 gigabaz üretir, ancak bu çıktılar son yıllarda büyüklük sıralarında artmıştır.

Ortaya çıkan bir yaklaşım, mikrobiyal genom montajına rehberlik etmek için aynı hücre içindeki herhangi iki DNA dizisinin yakınlığını ölçen, shotgun dizileme ve kromozom konformasyon yakalamayı (Hi-C) birleştirir. Pacific Biosciences'dan PacBio RSII ve PacBio Sequel ve Oxford Nanopore Technologies'den Nanopore MinION, GridION, PromethION dahil olmak üzere uzun okuma dizileme teknolojileri, montaj sürecini kolaylaştıracak uzun shotgun dizileme okumaları elde etmek için başka bir seçenektir.

biyoinformatik

Tüm metagenom av tüfeği dizilemesinden türetilen verilerin analizi için gerekli ana adımların şematik gösterimi. Her adımla ilgili yazılım italik olarak gösterilmiştir.

Metagenomik deneyler tarafından üretilen veriler hem çok büyük hem de doğası gereği gürültülüdür ve 10.000 kadar türü temsil eden parçalanmış veriler içerir. İnek rumen metagenomunun dizilenmesi , 279 gigabaz veya 279 milyar baz çift nükleotid dizi verisi üretirken, insan bağırsağı mikrobiyomu gen kataloğu, 567.7 gigabaz dizi verisinden bir araya getirilen 3.3 milyon gen tanımladı. Bu boyuttaki veri kümelerinden faydalı biyolojik bilgilerin toplanması, düzenlenmesi ve çıkarılması, araştırmacılar için önemli hesaplama zorluklarını temsil eder.

Sıra ön filtreleme

Metagenomik veri analizinin ilk adımı, gereksiz, düşük kaliteli dizilerin ve olası ökaryotik kökenli dizilerin (özellikle insan kaynaklı metagenomlarda) çıkarılması dahil olmak üzere belirli ön filtreleme adımlarının yürütülmesini gerektirir . Kirletici ökaryotik genomik DNA dizilerinin çıkarılması için mevcut yöntemler arasında Eu-Detect ve DeConseq bulunur.

toplantı

Genomik ve metagenomik projelerden elde edilen DNA dizi verileri esasen aynıdır, ancak genomik dizi verileri daha yüksek kapsama alanı sunarken metagenomik veriler genellikle yüksek oranda gereksizdir. Ayrıca, kısa okuma uzunluklarına sahip ikinci nesil dizileme teknolojilerinin artan kullanımı, gelecekteki metagenomik verilerin çoğunun hataya açık olacağı anlamına gelir. Kombinasyon halinde ele alındığında, bu faktörler, metagenomik dizi okumalarının genomlara birleştirilmesini zor ve güvenilmez hale getirir. Örnekte bulunan türlerin nispi bolluğundaki farklılık nedeniyle montajı özellikle zorlaştıran tekrarlayan DNA dizilerinin varlığından kaynaklanır . Misassemblies, kimerik içine birden fazla türden dizilerin kombinasyon içerebilir kontiglerin .

Çoğu montajların doğruluğunu artırmak için eşleştirilmiş uç etiketlerinden gelen bilgileri kullanabilen birkaç montaj programı vardır . Phrap veya Celera Assembler gibi bazı programlar, tek genomları birleştirmek için kullanılmak üzere tasarlanmıştır, ancak yine de metagenomik veri kümelerini birleştirirken iyi sonuçlar verir. Velvet assembler gibi diğer programlar, de Bruijn grafiklerinin kullanımıyla ikinci nesil sıralama ile üretilen daha kısa okumalar için optimize edilmiştir . Referans genomların kullanımı, araştırmacıların en bol bulunan mikrobiyal türlerin bir araya getirilmesini geliştirmesine olanak tanır, ancak bu yaklaşım, dizili genomların mevcut olduğu küçük mikrobiyal filum alt kümesi ile sınırlıdır. Bir montaj oluşturulduktan sonra, ek bir zorluk "metagenomik dekonvolüsyon" veya numunedeki hangi türlerden hangi dizilerin geldiğini belirlemektir.

gen tahmini

Metagenomik analiz boru hatları , birleştirilmiş kontiglerdeki kodlama bölgelerinin ek açıklamasında iki yaklaşım kullanır. İlk yaklaşım , genellikle BLAST araştırmaları yoluyla, dizi veri tabanlarında zaten halka açık olan genlerle homolojiye dayalı genleri belirlemektir . Bu tür bir yaklaşım MEGAN 4 programında uygulanmaktadır. İkincisi, ab initio , ilgili organizmalardan alınan gen eğitim setlerine dayalı kodlama bölgelerini tahmin etmek için dizinin içsel özelliklerini kullanır. GeneMark ve GLIMMER gibi programların aldığı yaklaşım budur . Ab initio tahmininin ana avantajı , dizi veritabanlarında homologları olmayan kodlama bölgelerinin saptanmasını sağlamasıdır; bununla birlikte, karşılaştırma için mevcut geniş bitişik genomik DNA bölgeleri olduğunda en doğrudur.

Türlerin çeşitliliği

Gen açıklamaları "ne"yi sağlarken, tür çeşitliliği ölçümleri "kim"i sağlar. Topluluk bileşimini ve metagenomlardaki işlevi birbirine bağlamak için diziler bindirilmelidir. Binning , belirli bir diziyi bir organizma ile ilişkilendirme sürecidir. Benzerliğe dayalı gruplamada, BLAST gibi yöntemler , mevcut genel veri tabanlarında filogenetik belirteçleri veya diğer benzer dizileri hızla aramak için kullanılır. Bu yaklaşım MEGAN'da uygulanmaktadır . Başka bir araç olan PhymmBL, okumaları atamak için enterpolasyonlu Markov modellerini kullanır . MetaPhlAn ve AMPHORA , gelişmiş hesaplama performansları ile organizmanın göreli bolluklarını tahmin etmek için benzersiz klada özgü belirteçlere dayanan yöntemlerdir. mOTU'lar ve MetaPhyler gibi diğer araçlar, prokaryotik türlerin profilini çıkarmak için evrensel işaretleyici genleri kullanır. İle Motus profilcisine mikrobiyal topluluk çeşitliliğin tahminini geliştirmek, bir referans genom olmadan türler profil mümkündür. SLIMM gibi son yöntemler, yanlış pozitif isabetleri en aza indirmek ve güvenilir göreceli bolluklar elde etmek için bireysel referans genomlarının okuma kapsama alanını kullanır. Bileşime dayalı gruplamada yöntemler, oligonükleotid frekansları veya kodon kullanım yanlılığı gibi dizinin içsel özelliklerini kullanır . Diziler bir kez bindirildiğinde, çeşitlilik ve zenginliğin karşılaştırmalı analizini yapmak mümkündür.

Veri entegrasyonu

Üstel olarak büyüyen dizi verilerinin büyük miktarı, metagenomik projelerle ilişkili meta verilerin karmaşıklığıyla karmaşıklaşan göz korkutucu bir zorluktur . Meta veriler, numunenin üç boyutlu (derinlik veya yükseklik dahil) coğrafyası ve çevresel özellikleri, numune sahasına ilişkin fiziksel veriler ve numune alma metodolojisi hakkında ayrıntılı bilgiler içerir. Bu bilgi, hem tekrarlanabilirliği sağlamak hem de aşağı akış analizini etkinleştirmek için gereklidir . Önemi nedeniyle, meta veriler ve ortak veri incelemesi ve iyileştirme, Genomes OnLine Database (GOLD) gibi özel veritabanlarında bulunan standartlaştırılmış veri formatlarını gerektirir.

Meta verileri ve dizi verilerini entegre etmek için çeşitli araçlar geliştirilmiştir ve bir dizi ekolojik endeks kullanılarak farklı veri kümelerinin aşağı yönlü karşılaştırmalı analizlerine olanak tanır. 2007 yılında, Folker Meyer ve Robert Edwards ile Argonne Ulusal Laboratuvarı ve Chicago Üniversitesi'nden bir ekip, metagenom veri seti analizi için bir topluluk kaynağı olan Subsystem Technology sunucusunu ( MG-RAST ) kullanan Metagenomics Rapid Annotation'ı yayınladı . Haziran 2012 itibariyle, MG-RAST içinde karşılaştırma için ücretsiz olarak sunulan 10.000'den fazla kamuya açık veri seti ile 14,8 terabaz (14x10 12 baz) DNA'nın üzerinde analiz edilmiştir. 8.000'den fazla kullanıcı MG-RAST'a toplam 50.000 metagenom gönderdi. Entegre Mikrobiyal Genom / Metagenomes (IMG / m) sistemi aynı zamanda gelen dahil referans izole genomları dayalı kendi metagenome dizisine dayanan mikrobiyal toplulukların işlevsel analizi için bir araç toplama sağlar entegre Mikrobiyal Genom (IMG) sistemi ve genomik Ansiklopedisi Bakteriler ve Arkeler (GEBA) projesi.

En yüksek verimlilik metagenome tüfek verileri analiz etmek için ilk bağımsız araçlardan biri olmuştur MEGAN (meta-Genom Analyzer). Programın ilk versiyonu 2005 yılında bir mamut kemiğinden elde edilen DNA dizilerinin metagenomik içeriğini analiz etmek için kullanıldı. Bir referans veritabanına karşı bir BLAST karşılaştırmasına dayalı olarak, bu araç, okumaları basit bir en düşük ortak ata (LCA) algoritması kullanarak NCBI taksonomisinin düğümlerine veya SEED veya KEGG sınıflandırmalarının düğümlerine yerleştirerek hem sınıflandırma hem de işlevsel gruplama gerçekleştirir. , sırasıyla.

Hızlı ve ucuz dizileme araçlarının ortaya çıkmasıyla, DNA dizilerinin veri tabanlarının büyümesi artık üsteldir (örneğin, NCBI GenBank veri tabanı). MG-RAST veya MEGAN gibi BLAST tabanlı yaklaşımlar, büyük örneklere açıklama eklemek için yavaş çalıştığından (örneğin, küçük/orta boyutlu bir veri kümesini/örneği işlemek için birkaç saat) yüksek verimli sıralamaya ayak uydurmak için daha hızlı ve verimli araçlar gereklidir. ). Böylece, son zamanlarda daha uygun fiyatlı güçlü sunucular sayesinde ultra hızlı sınıflandırıcılar ortaya çıktı. Bu araçlar, taksonomik açıklamayı son derece yüksek hızda gerçekleştirebilir, örneğin CLARK (CLARK'ın yazarlarına göre, "dakikada 32 milyon metagenomik kısa okuma"yı doğru bir şekilde sınıflandırabilir). Böyle bir hızda, çok büyük bir veri kümesi/bir milyar kısa okuma örneği yaklaşık 30 dakikada işlenebilir.

Antik DNA içeren örneklerin artan mevcudiyeti ve bu örneklerin doğasıyla ilişkili belirsizlik (antik DNA hasarı) nedeniyle, muhafazakar benzerlik tahminleri üretebilen hızlı bir araç kullanıma sunulmuştur. FALCON'un yazarlarına göre, bellek ve hız performansını etkilemeden rahat eşikler kullanabilir ve mesafeleri düzenleyebilir.

karşılaştırmalı metagenomik

Metagenomlar arasındaki karşılaştırmalı analizler, karmaşık mikrobiyal toplulukların işlevi ve bunların konak sağlığındaki rolü hakkında ek bilgi sağlayabilir. Metagenomlar arasında ikili veya çoklu karşılaştırmalar, dizi kompozisyonu ( GC içeriği veya genom boyutunun karşılaştırılması), taksonomik çeşitlilik veya fonksiyonel tamamlayıcı düzeyinde yapılabilir . Popülasyon yapısı ve filogenetik çeşitlilik karşılaştırmaları, 16S ve diğer filogenetik işaretleyici genler temelinde veya - düşük çeşitliliğe sahip topluluklar durumunda - metagenomik veri setinden genom rekonstrüksiyonu ile yapılabilir. Metagenomlar arasındaki fonksiyonel karşılaştırmalar, dizileri COG veya KEGG gibi referans veritabanlarıyla karşılaştırarak ve bolluğu kategoriye göre tablolayarak ve istatistiksel anlamlılık için herhangi bir farkı değerlendirerek yapılabilir. Bu gen merkezli yaklaşım, taksonomik gruplardan ziyade bir bütün olarak topluluğun fonksiyonel tamamlayıcısını vurgular ve fonksiyonel tamamlayıcıların benzer çevresel koşullar altında benzer olduğunu gösterir. Sonuç olarak, metagenomik örneğin çevresel bağlamına ilişkin meta veriler, araştırmacılara habitatın topluluk yapısı ve işlevi üzerindeki etkisini inceleme yeteneği sağladığı için karşılaştırmalı analizlerde özellikle önemlidir.

Ek olarak, çeşitli mikrobiyal topluluklar arasındaki farklılıkları tanımlamak için oligonükleotit kullanım kalıplarını da kullanan birkaç çalışma vardır. Bu tür metodolojilerin örnekleri arasında Willner ve diğerleri tarafından dinükleotid göreli bolluk yaklaşımı yer alır. ve Ghosh ve diğerlerinin HabiSign yaklaşımı. Bu son çalışma, aynı zamanda, tetranükleotit kullanım modellerindeki farklılıkların, belirli habitatlardan kaynaklanan genleri (veya metagenomik okumaları) tanımlamak için kullanılabileceğini göstermiştir. Ek olarak, TriageTools veya Compareads gibi bazı yöntemler, iki okuma seti arasında benzer okumaları tespit eder. Benzerlik ölçüsü de uygulanır uzunluğu aynı sözcük sayısına dayanır okur k okur çiftleri tarafından paylaşılan.

Karşılaştırmalı metagenomikteki temel amaç, belirli bir ortama belirli özellikler kazandırmaktan sorumlu olan mikrobiyal grup(lar)ı belirlemektir. Ancak, dizileme teknolojilerindeki sorunlar nedeniyle, artefaktların metagenomSeq'deki gibi hesaba katılması gerekir. Diğerleri, yerleşik mikrobiyal gruplar arasındaki mikrobiyal etkileşimleri karakterize etmiştir. Bir GUI Toplum Analiz adı karşılaştırmalı metagenomic analizi uygulaması Kuntal ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir tabanlı. Bu, yalnızca analiz edilen mikrobiyal topluluklardaki farklılıkların (taksonomik bileşimleri açısından) hızlı bir şekilde görselleştirilmesini kolaylaştıran değil, aynı zamanda burada meydana gelen doğal mikrobiyal etkileşimler hakkında bilgi sağlayan korelasyon tabanlı bir grafik düzeni algoritması uygular. Özellikle, bu yerleşim algoritması, çeşitli taksonomik grupların bolluk değerlerini basitçe karşılaştırmak yerine, olası mikrobiyal etkileşim modellerine dayalı olarak metagenomların gruplandırılmasını da sağlar. Ayrıca araç, kullanıcıların mikrobiyomlar arasında standart karşılaştırmalı analizler yapmalarını sağlayan çeşitli etkileşimli GUI tabanlı işlevsellikler uygular.

Veri analizi

topluluk metabolizması

Doğal veya tasarlanmış ( biyoreaktörler gibi ) birçok bakteri topluluğunda, bazı organizmaların atık ürünlerinin diğerleri için metabolit olduğu metabolizmada ( Sentrofi ) önemli bir iş bölümü vardır . Böyle bir sistemde, metan biyoreaktör, fonksiyonel stabilite birkaç varlığını gerektirir sintrofik türlerinin ( Syntrophobacterales ve Synergistia tamamen metabolize atık (ham bilgi çevirmek için birlikte çalışan) metan ). Mikrodiziler veya proteomik araştırmacılarla karşılaştırmalı gen çalışmaları ve ekspresyon deneyleri kullanmak, tür sınırlarının ötesine geçen bir metabolik ağı bir araya getirebilir. Bu tür çalışmalar, hangi proteinlerin hangi versiyonlarının hangi türler tarafından, hatta hangi türlerin hangi suşları tarafından kodlandığı hakkında detaylı bilgi gerektirir. Bu nedenle, topluluk genomik bilgisi, metabolitlerin bir topluluk tarafından nasıl aktarıldığını ve dönüştürüldüğünü belirleme arayışında başka bir temel araçtır ( metabolomik ve proteomik ile).

metatranskriptomik

Metagenomik, araştırmacıların mikrobiyal toplulukların işlevsel ve metabolik çeşitliliğine erişmesine izin verir, ancak bu süreçlerden hangisinin aktif olduğunu gösteremez. Metagenomik mRNA'nın ( metatranskriptome ) çıkarılması ve analizi , karmaşık toplulukların düzenlenmesi ve ekspresyon profilleri hakkında bilgi sağlar . Çevresel RNA'nın toplanmasındaki teknik zorluklar ( örneğin mRNA'nın kısa yarı ömrü ) nedeniyle, bugüne kadar mikrobiyal topluluklara ilişkin nispeten az sayıda yerinde metatranskriptomik çalışma yapılmıştır. Başlangıçta mikrodizi teknolojisi ile sınırlı olmakla birlikte , metatranskriptomik çalışmalar , ilk olarak topraklarda amonyak oksidasyonunun analizinde kullanılan bir mikrobiyal topluluğun tam genom ekspresyonunu ve miktarını ölçmek için transkriptomik teknolojilerini kullanmıştır.

virüsler

Metagenomik dizileme, viral toplulukların çalışmasında özellikle yararlıdır. Virüsler ortak bir evrensel filogenetik belirteçten yoksun olduğundan ( bakteriler ve arkeler için 16S RNA ve ökarya için 18S RNA gibi), viral topluluğun genetik çeşitliliğine çevresel bir örnekten erişmenin tek yolu metagenomiktir. Viral metagenomlar (viromlar da denir) bu nedenle viral çeşitlilik ve evrim hakkında daha fazla bilgi sağlamalıdır. Örneğin, Giant Virus Finder adlı metagenomik bir boru hattı, tuzlu bir çölde ve Antarktika kuru vadilerinde dev virüslerin varlığının ilk kanıtını gösterdi .

Uygulamalar

Metagenomik, çok çeşitli alanlarda bilgiyi ilerletme potansiyeline sahiptir. Tıp , mühendislik , tarım , sürdürülebilirlik ve ekoloji alanlarındaki pratik zorlukları çözmek için de uygulanabilir .

Tarım

Topraklar bitkilerin büyüdüğü toprakta bir gram yaklaşık 10 içeren, mikrobiyal toplulukların yaşadığı 9 -10 10 sekans bilgilerinin bir gigabase yaklaşık ihtiva mikrobiyal hücreleri. Topraklarda yaşayan mikrobiyal topluluklar, bilimin bildiği en karmaşık topluluklardan bazılarıdır ve ekonomik önemlerine rağmen hala tam olarak anlaşılamamıştır. Mikrobiyal konsorsiyumlar , atmosferik nitrojeni sabitleme, besin döngüsü , hastalık bastırma ve demir ve diğer metalleri ayırma dahil olmak üzere bitki büyümesi için gerekli olan çok çeşitli ekosistem hizmetlerini gerçekleştirir . Fonksiyonel metagenomik stratejiler, bu mikrobiyal toplulukların ekimden bağımsız olarak incelenmesi yoluyla bitkiler ve mikroplar arasındaki etkileşimleri keşfetmek için kullanılmaktadır. Metagenomik yaklaşımlar, daha önce ekilmemiş veya nadir topluluk üyelerinin besin döngüsündeki rolüne ve bitki büyümesinin desteklenmesine ilişkin içgörülere izin vererek, mahsullerde ve hayvanlarda gelişmiş hastalık tespitine ve bu ilişkiyi kullanarak mahsul sağlığını iyileştiren gelişmiş çiftçilik uygulamalarının uyarlanmasına katkıda bulunabilir. Mikroplar ve bitkiler arasında.

biyoyakıt

Biyo- olan yakıtlar türetilen biyokütle dönüştürülmesinde olarak dönüştürme, selüloz içerdiği , mısır sapı, switchgrass içine ve diğer biyokütle selülozik etanol . Bu süreç, selülozu şekere dönüştüren mikrobiyal konsorsiyuma (birliğe) , ardından şekerlerin etanole fermantasyonuna bağlıdır . Mikroplar ayrıca metan ve hidrojen de dahil olmak üzere çeşitli biyoenerji kaynakları üretir .

Verimli endüstriyel ölçekli parçalama biyokütle yeni gerektirir enzimler daha yüksek verimlilik ve düşük maliyetle. Metagenomic hedef izin kompleks mikrobiyal toplulukların analizine yaklaşımlar tarama arasında enzimler gibi, biyoyakıt üretiminde endüstriyel uygulamalar ile glikozit hidrolaz . Ayrıca, bu mikrobiyal toplulukların nasıl işlediğine dair bilgi, onları kontrol etmek için gereklidir ve metagenomik, onların anlaşılmasında önemli bir araçtır. Metagenomic yaklaşımlar arasındaki karşılaştırmalı analizler izin yakınsak gibi mikrobik sistemlerde biyogaz fermentörlere veya böcek otobur gibi mantar bahçesi içinde yaprakkesici karıncalar .

biyoteknoloji

Mikrobiyal topluluklar, rekabet ve iletişimde kullanılan çok çeşitli biyolojik olarak aktif kimyasallar üretir. Bugün kullanılan ilaçların çoğu aslında mikroplarda bulundu; Kültüre alınamayan mikropların zengin genetik kaynağının madenciliğinde son zamanlarda kaydedilen ilerlemeler, yeni genlerin, enzimlerin ve doğal ürünlerin keşfedilmesine yol açmıştır. Metagenomik uygulaması, enzim katalizli kiral sentezin yararının giderek daha fazla kabul gördüğü emtia ve ince kimyasalların , zirai kimyasalların ve farmasötiklerin geliştirilmesine olanak sağlamıştır .

Metagenomik verilerin biyolojik olarak araştırılmasında iki tür analiz kullanılır : ifade edilen bir özellik için fonksiyona dayalı tarama ve ilgili DNA dizileri için diziye dayalı tarama. Fonksiyona dayalı analiz, istenen bir özelliği veya faydalı aktiviteyi ifade eden klonları tanımlamayı ve ardından biyokimyasal karakterizasyon ve dizi analizini amaçlar. Bu yaklaşım, uygun bir ekranın mevcudiyeti ve istenen özelliğin konakçı hücrede ifade edilmesi gerekliliği ile sınırlıdır. Ayrıca, düşük keşif oranı (taranan 1.000 klonda birden az) ve emek-yoğun doğası bu yaklaşımı daha da sınırlandırmaktadır. Buna karşılık, diziye dayalı analiz, ilgili dizi için klonları taramak üzere PCR primerlerini tasarlamak için korunmuş DNA dizilerini kullanır . Klonlamaya dayalı yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, yalnızca sıralı bir yaklaşım kullanmak, gereken tezgah çalışması miktarını daha da azaltır. Büyük ölçüde paralel dizilemenin uygulanması, yüksek verimli biyoinformatik analiz boru hatları gerektiren, oluşturulan dizi verilerinin miktarını da büyük ölçüde artırır. Taramaya yönelik dizi odaklı yaklaşım, genel dizi veri tabanlarında bulunan gen fonksiyonlarının genişliği ve doğruluğu ile sınırlıdır. Pratikte deneyler, ilgilenilen fonksiyona, taranacak örneğin karmaşıklığına ve diğer faktörlere dayalı olarak hem fonksiyonel hem de dizi bazlı yaklaşımların bir kombinasyonunu kullanır. Metagenomikleri ilaç keşfi için bir biyoteknoloji olarak kullanma başarısına bir örnek, malasidin antibiyotikleriyle gösterilmiştir.

Ekoloji

Metagenomik, bu akışta bulunanlar gibi yüzey kömür madenciliğinden asit drenajı alan mikrobiyal toplulukların çalışmasına izin verir.

Metagenomik, çevresel toplulukların işlevsel ekolojisi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Avustralya deniz aslanlarının dışkılamalarında bulunan bakteriyel konsorsiyumların metagenomik analizi, besin açısından zengin deniz aslanı dışkılarının kıyı ekosistemleri için önemli bir besin kaynağı olabileceğini düşündürmektedir. Bunun nedeni, dışkılama ile eş zamanlı olarak dışarı atılan bakterilerin, dışkıdaki besin maddelerini besin zincirine alınabilecek biyoyararlı bir forma parçalamakta usta olmalarıdır.

DNA dizilimi ayrıca bir su kütlesinde bulunan türleri, havadan filtrelenen kalıntıları, kir örneğini ve hatta hayvan dışkısını tanımlamak için daha geniş bir şekilde kullanılabilir. Bu, istilacı türlerin ve nesli tükenmekte olan türlerin aralığını belirleyebilir ve mevsimsel popülasyonları takip edebilir.

Çevresel iyileştirme

Metagenomik, kirleticilerin ekosistemler üzerindeki etkisini izlemek ve kirlenmiş ortamları temizlemek için stratejileri geliştirebilir . Topluluklar kirleticiler ile baş nasıl mikrobiyal anlayış Artırıldı kirlilikten kurtarmak için Kirlenmiş sitelerin potansiyeli değerlendirmelerini geliştirir ve şansını arttırır bioaugmentation veya biostimulation başarılı denemeler.

Bağırsak mikrobu karakterizasyonu

Mikrobiyal topluluklar , insan sağlığının korunmasında kilit bir rol oynamaktadır , ancak bunların bileşimi ve bunu yapma mekanizmaları gizemli kalmaktadır. Metagenomik dizileme, en az 250 kişiden 15-18 vücut bölgesinden mikrobiyal toplulukları karakterize etmek için kullanılmaktadır. Bu, temel bir insan mikrobiyomu olup olmadığını belirlemek , insan mikrobiyomunda insan sağlığı ile ilişkilendirilebilecek değişiklikleri anlamak ve bu hedefleri desteklemek için yeni teknolojik ve biyoinformatik araçlar geliştirmek için birincil hedefleri olan İnsan Mikrobiyomu girişiminin bir parçasıdır .

MetaHit (Metagenomics of the Human Intestinal Tract) projesinin bir parçası olan bir başka tıbbi çalışma, Danimarka ve İspanya'dan sağlıklı, fazla kilolu ve irritabl bağırsak hastalığı hastalarından oluşan 124 kişiden oluşuyordu. Çalışma, gastrointestinal bakterilerin derinliğini ve filogenetik çeşitliliğini kategorize etmeye çalıştı. Illumina GA dizi verilerini ve özellikle derleme kısa okumaları için tasarlanmış de Bruijn grafik tabanlı bir araç olan SOAPdenovo'yu kullanarak, toplam bitiş uzunluğu 10,3 Gb ve N50 uzunluğu 2,2 kb için 500 bp'den daha büyük 6,58 milyon bitişik oluşturabildiler.

Çalışma, iki bakteri bölümünün, Bacteroidetes ve Firmicutes'in, distal bağırsak bakterilerine hakim olan bilinen filogenetik kategorilerin %90'ından fazlasını oluşturduğunu göstermiştir. Bu araştırmacılar, bağırsakta bulunan nispi gen frekanslarını kullanarak, bağırsak yolunun sağlığı için kritik öneme sahip 1.244 metagenomik kümeyi belirlediler. Bu aralık kümelerinde iki tür işlev vardır: temizlik ve bağırsaklara özgü olanlar. Temizlik gen kümeleri tüm bakterilerde gereklidir ve genellikle merkezi karbon metabolizması ve amino asit sentezi dahil olmak üzere ana metabolik yollarda ana oyunculardır. Bağırsaklara özgü işlevler, konakçı proteinlere yapışmayı ve şekerlerin küresel dizi glikolipidlerinden hasat edilmesini içerir. İrritabl barsak sendromu olan hastaların, irritabl barsak sendromundan mustarip olmayan bireylere göre %25 daha az gen ve daha düşük bakteri çeşitliliği sergiledikleri gösterilmiştir, bu da hastaların bağırsak biyom çeşitliliğindeki değişikliklerin bu durumla ilişkili olabileceğini göstermektedir.

Bu çalışmalar bazı potansiyel olarak değerli tıbbi uygulamaları vurgularken, okumaların yalnızca %31-48,8'i 194 genel insan bağırsak bakteri genomuna ve %7,6-21.2'si GenBank'ta bulunan bakteri genomlarına uyumlu hale getirilebilir, bu da hala çok daha fazla araştırma yapılması gerektiğini gösterir. yeni bakteri genomlarını yakalayın.

Olarak insan mikrobiyomu Projesi (HMP), mikrobiyal topluluklar yüksek verimli DNA dizilemesi kullanılarak tahlil edilmiştir gut. HMP, bireysel mikrobiyal türlerin aksine, tüm vücut habitatları arasında değişen frekanslarda birçok metabolik süreç bulunduğunu göstermiştir. İnsan mikrobiyomu projesinin bir parçası olarak 102 bireyde yedi ana vücut bölgesinden alınan 649 metagenomun mikrobiyal toplulukları incelenmiştir . Metagenomik analiz, mikrobiyom içindeki 168 fonksiyonel modül ve 196 metabolik yol arasında niş spesifik bolluktaki varyasyonları ortaya çıkardı. Bunlar, bağırsaktaki glikozaminoglikan bozunmasının yanı sıra arka fornikste konak fenotipine (vajinal pH) bağlı fosfat ve amino asit taşınmasını içeriyordu. HMP, tanı ve kanıta dayalı tıpta metagenomiklerin faydasını gün ışığına çıkarmıştır . Bu nedenle metagenomik, Kişiselleştirilmiş tıp alanındaki birçok acil sorunu ele almak için güçlü bir araçtır .

Bulaşıcı hastalık teşhisi

Enfeksiyöz ve enfeksiyöz olmayan hastalık arasında ayrım yapmak ve enfeksiyonun altında yatan etiyolojiyi belirlemek oldukça zor olabilir. Örneğin, en son teknoloji klinik laboratuvar yöntemleri kullanılarak yapılan kapsamlı testlere rağmen ensefalit vakalarının yarısından fazlası teşhis edilmemiştir. Metagenomik dizileme, bir hastanın örneğinde bulunan genetik materyali, bilinen tüm mikroskobik insan patojenlerinin veri tabanlarıyla ve diğer binlerce bakteriyel, viral, fungal ve parazitik organizmayla ve antimikrobiyal direnç gen dizileriyle ilgili veri tabanlarıyla karşılaştırarak enfeksiyonu teşhis etmek için hassas ve hızlı bir yöntem olarak umut vaat etmektedir. ilişkili klinik fenotipler ile.

Arbovirüs sürveyansı

Metagenomik, sivrisinekler ve keneler gibi hematophagous (kanla beslenen) böcekler tarafından vektör edilen patojenlerin çeşitliliğini ve ekolojisini karakterize etmeye yardımcı olmak için paha biçilmez bir araç olmuştur. Metagenomik, halk sağlığı yetkilileri ve kuruluşları tarafından arbovirüslerin sürveyansı için rutin olarak kullanılmaktadır.

Ayrıca bakınız

Referanslar

Dış bağlantılar