mikroskopi - Microscopy

Biyokimyasal laboratuvarda mikroskobik inceleme

Mikroskopi , çıplak gözle görülemeyen nesneleri ve nesnelerin alanlarını ( normal gözün çözünürlük aralığı içinde olmayan nesneler) görüntülemek için mikroskop kullanmanın teknik alanıdır . Üç iyi bilinen mikroskopi dalı vardır: optik , elektron ve taramalı prob mikroskobu , ortaya çıkan X-ışını mikroskobu alanı ile birlikte .

Optik mikroskopi ve elektron mikroskobu , numune ile etkileşime giren elektromanyetik radyasyon /elektron ışınlarının kırınımını , yansımasını veya kırılmasını ve bir görüntü oluşturmak için saçılan radyasyonun veya başka bir sinyalin toplanmasını içerir. Bu işlem, numunenin geniş alanlı ışınlanmasıyla (örneğin standart ışık mikroskobu ve transmisyon elektron mikroskobu ) veya numune üzerinde ince bir ışının taranmasıyla (örneğin konfokal lazer tarama mikroskobu ve taramalı elektron mikroskobu ) gerçekleştirilebilir. Taramalı sonda mikroskopisi , bir tarama sondasının ilgilenilen nesnenin yüzeyi ile etkileşimini içerir. Mikroskopinin gelişimi biyolojide devrim yarattı , histoloji alanını doğurdu ve bu nedenle yaşam ve fizik bilimlerinde temel bir teknik olmaya devam ediyor . X-ışını mikroskobu üç boyutludur ve tahribatsızdır, aynı numunenin yerinde veya 4D çalışmalar için tekrar tekrar görüntülenmesine izin verir ve daha yüksek çözünürlük tekniklerine feda etmeden önce çalışılan numunenin "içini görme" yeteneği sağlar. Bir 3D X-ışını mikroskobu, bilgisayarlı tomografi (microCT) tekniğini kullanır, numuneyi 360 derece döndürür ve görüntüleri yeniden oluşturur. CT tipik olarak düz panel ekran ile gerçekleştirilir. Bir 3D X-ışını mikroskobu, örneğin 4X ila 40X arasında bir dizi hedef kullanır ve ayrıca düz bir panel içerebilir.

Tarih

Genellikle ilk tanınmış olduğu düşünülen microscopist ve mikrobiyolog , Antonie van Leeuwenhoek iyi mikroskobu alanında ve kurulması yönünde yaptığı katkılardan dolayı öncü çalışmaları ile bilinen mikrobiyoloji bilimsel bir disiplin olarak.

Mikroskopi alanı ( optik mikroskopi ) en azından 17. yüzyıla kadar uzanır. Daha önce mikroskoplar, tek mercek büyütücü gözlük kadar geriye de lenslerin yaygın kullanılmasının yanı en azından sınırlı büyütme ile, tarih gözlükleri 13. yüzyılda ancak daha gelişmiş bileşik mikroskoplar ilk 1620 civarında Avrupa'da ortaya çıktı mikroskobu en erken uygulayıcıları dahil Galileo Galilei , 1610'da küçük nesneleri yakından görmek için teleskopunu yakın odaklayabildiğini bulan ve 1620 civarında bileşik mikroskobu icat etmiş olabilecek Cornelis Drebbel Antonie van Leeuwenhoek , 1670'lerde çok yüksek büyütmeli basit bir mikroskop geliştirdi ve genellikle kabul edilen ilk mikroskopist ve mikrobiyolog .

Optik mikroskopi

Stereo mikroskop

Optik veya ışık mikroskobu, numunenin büyütülmüş bir görüntüsünü sağlamak için numuneden iletilen veya yansıyan görünür ışığın tek bir mercek veya çoklu merceklerden geçirilmesini içerir. Ortaya çıkan görüntü doğrudan gözle algılanabilir, bir fotoğraf plakasında görüntülenebilir veya dijital olarak yakalanabilir . Ekleri ile birlikte tek lens veya uygun aydınlatma ekipmanı, numune aşaması ve desteği ile birlikte lensler ve görüntüleme ekipmanı sistemi, temel ışık mikroskobunu oluşturur. En son gelişme, ilgi konusu sergiye odaklanmak için bir CCD kamera kullanan dijital mikroskoptur . Görüntü bir bilgisayar ekranında gösterilir, bu nedenle göz mercekleri gereksizdir.

sınırlamalar

Standart optik mikroskopinin ( parlak alan mikroskobu ) sınırlamaları üç alanda yatmaktadır;

  • Bu teknik, yalnızca karanlık veya güçlü bir şekilde kırılan nesneleri etkili bir şekilde görüntüleyebilir.
  • Bir bulunmaktadır kırınım sınırlı bir olay dalga boyuna bağlı olarak çözünürlüğü; görünür aralıkta, optik mikroskopinin çözünürlüğü yaklaşık 0,2 mikrometre ile sınırlıdır   ( bakınız: mikroskop ) ve pratik büyütme sınırı ~ 1500x ile sınırlıdır.
  • Odak düzleminin dışındaki noktalardan gelen odak dışı ışık, görüntü netliğini azaltır.


Özellikle canlı hücreler, hücrenin iç yapıları renksiz ve şeffaf olduğundan, başarılı bir şekilde incelenmek için genellikle yeterli kontrasttan yoksundur. Artışın aksine en yaygın yolu için leke seçici boyalarla farklı yapıları, ama bu genellikle öldürme ve kapsar sabitleme örnek. Boyama , örneğin işlenmesinden kaynaklanan ve dolayısıyla örneğin meşru özellikleri olmayan belirgin yapısal ayrıntılar olan artefaktları da ortaya çıkarabilir . Genel olarak, bu teknikler hücre yapılarının kırılma indisindeki farklılıklardan yararlanır. Parlak alan mikroskobu, bir cam pencereden bakmakla karşılaştırılabilir: kişi camı değil, yalnızca camın üzerindeki kiri görür. Cam daha yoğun bir malzeme olduğu için bir fark vardır ve bu da ışığın geçiş fazında bir fark yaratır. İnsan gözü bu faz farkına duyarlı değildir, ancak bu faz farkını genlikte (ışık yoğunluğu) bir farka dönüştürmek için akıllı optik çözümler geliştirilmiştir.

teknikler

Numune kontrastını iyileştirmek veya bir numunedeki belirli yapıları vurgulamak için özel teknikler kullanılmalıdır. Kontrastı artırmak veya bir numuneyi etiketlemek için çok çeşitli mikroskopi teknikleri mevcuttur.

Parlak bir alan

Parlak alan mikroskobu, tüm ışık mikroskobu tekniklerinin en basitidir. Örnek aydınlatma, iletilen beyaz ışık yoluyla, yani aşağıdan aydınlatılır ve yukarıdan gözlemlenir. Sınırlamalar, çoğu biyolojik numunenin düşük kontrastını ve odak dışı malzemenin bulanıklığından dolayı düşük görünür çözünürlüğü içerir. Tekniğin basitliği ve gereken minimum numune hazırlama önemli avantajlardır.

eğik aydınlatma

Eğik (yandan) aydınlatmanın kullanılması, görüntüye üç boyutlu (3B) bir görünüm verir ve aksi takdirde görünmez özellikleri vurgulayabilir. Bu yönteme dayanan daha yeni bir teknik , hücre kültüründe kullanılmak üzere ters çevrilmiş mikroskoplarda bulunan bir sistem olan Hoffmann'ın modülasyon kontrastıdır . Eğik aydınlatma, parlak alan mikroskopisi ile aynı sınırlamalardan muzdariptir (birçok biyolojik numunenin düşük kontrastı; odak dışı nesneler nedeniyle düşük görünür çözünürlük).

Karanlık alan

Karanlık alan mikroskobu, boyanmamış, şeffaf numunelerin kontrastını iyileştirmeye yönelik bir tekniktir. Karanlık alan aydınlatması, görüntü düzlemine giren ve yalnızca numune tarafından saçılan ışığı toplayarak doğrudan iletilen (dağılmamış) ışığın miktarını en aza indirmek için dikkatlice hizalanmış bir ışık kaynağı kullanır. Karanlık alan, küçük ekipman kurulumu veya numune hazırlığı gerektirirken, özellikle şeffaf nesnelerin görüntü kontrastını önemli ölçüde iyileştirebilir. Bununla birlikte, teknik, birçok biyolojik örneğin son görüntüsünde düşük ışık yoğunluğundan muzdariptir ve düşük görünen çözünürlükten etkilenmeye devam etmektedir.

Rheinberg aydınlatması altında bir diatom

Rheinberg aydınlatması , yüksek açıklıktaki ışık ışınlarının düşük açıklıktakilerden farklı renkte olması için yoğunlaştırıcının hemen önüne şeffaf, renkli filtrelerin yerleştirildiği karanlık alan aydınlatmasının özel bir çeşididir (yani numunenin arka planı mavi olabilirken, nesne kendinden parlak kırmızı görünür). Diğer renk kombinasyonları da mümkündür, ancak etkinlikleri oldukça değişkendir.

Dispersiyon boyama

Dispersiyon boyama, renksiz bir nesnenin renkli görüntüsüyle sonuçlanan optik bir tekniktir. Bu optik bir boyama tekniğidir ve renk efekti oluşturmak için leke veya boya gerektirmez. Daha geniş dispersiyon boyama tekniğinde kullanılan beş farklı mikroskop konfigürasyonu vardır. Aydınlık alan Becke çizgisi, eğik, karanlık alan, faz kontrastı ve objektif durdurma dispersiyon boyamasını içerir.

Faz kontrastı

Kondrositleri ve organelleri , boşlukları ve hücre dışı matrisi gösteren , kireçten arındırılmamış hiyalin kıkırdağın faz kontrastlı ışık mikrografı .
Gelen elektron mikroskopisi : Faz-kontrast görüntüleme

Daha karmaşık teknikler, optik yoğunlukta orantılı farklılıklar gösterecektir. Faz kontrastı , kırılma indeksindeki farklılıkları kontrasttaki farklılık olarak gösteren, yaygın olarak kullanılan bir tekniktir . 1930'larda Hollandalı fizikçi Frits Zernike tarafından geliştirildi (1953'te Nobel Ödülü'ne layık görüldü). Örneğin bir hücredeki çekirdek, çevreleyen sitoplazmaya karşı karanlık bir şekilde görünecektir. Kontrast mükemmel; ancak kalın nesnelerle kullanım için değildir. Sıklıkla, küçük nesnelerin etrafında bile ayrıntıları gizleyen bir hale oluşur. Sistem, kondansatörde bir ışık konisi üreten dairesel bir halkadan oluşur. Bu koni, faz hedefi dahilinde benzer büyüklükte bir halka üzerine bindirilir. Her objektifin farklı bir halka boyutu vardır, bu nedenle her objektif için başka bir kondansatör ayarı seçilmelidir. Objektifteki halka özel optik özelliklere sahiptir: her şeyden önce, doğrudan ışığın yoğunluğunu azaltır, ancak daha da önemlisi, yaklaşık çeyrek dalga boyunda yapay bir faz farkı yaratır. Bu doğrudan ışığın fiziksel özellikleri değiştikçe, kırılan ışıkla girişim meydana gelir ve bu da faz kontrast görüntüsüne neden olur. Faz kontrast mikroskopisinin bir dezavantajı, halo oluşumudur (halo-ışık halkası).

Diferansiyel girişim kontrastı

Daha üstün ve çok daha pahalı olan girişim kontrast kullanımıdır . Optik yoğunluktaki farklılıklar, kabartmadaki farklılıklar olarak ortaya çıkacaktır. Bir hücre içindeki bir çekirdek , Georges Nomarski'ye göre en sık kullanılan diferansiyel girişim kontrast sisteminde aslında bir küre olarak görünecektir . Ancak, bunun optik bir etki olduğu ve kabartmanın mutlaka gerçek şekle benzemediği akılda tutulmalıdır . Kontrast çok iyidir ve kondansatör açıklığı tamamen açık olarak kullanılabilir, böylece alan derinliğini azaltır ve çözünürlüğü en üst düzeye çıkarır.

Sistem, ışığı sıradan ve olağanüstü bir ışında bölen kondansatörde özel bir prizmadan ( Nomarski prizma , Wollaston prizma ) oluşur . İki ışın arasındaki uzamsal fark minimumdur (hedefin maksimum çözünürlüğünden daha az). Numuneden geçtikten sonra, kirişler objektifte benzer bir prizma ile yeniden birleştirilir.

Homojen bir numunede, iki ışın arasında hiçbir fark yoktur ve kontrast oluşturulmaz. Bununla birlikte, kırılma sınırına yakın (örneğin sitoplazma içindeki bir çekirdek), sıradan ve olağanüstü ışın arasındaki fark, görüntüde bir rahatlama oluşturacaktır. Diferansiyel girişim kontrastının çalışması için polarize bir ışık kaynağı gerekir; ışık yoluna, biri kondansatörün (polarizör) altına ve diğeri objektifin (analizör) üstüne olmak üzere iki polarizasyon filtresi takılmalıdır.

Not: Bir mikroskobun optik tasarımının, iki ışın arasında kayda değer bir yanal ayrılma ürettiği durumlarda, kabartma görüntülerle sonuçlanmayan, ancak yine de kütle kalınlıklarının kantitatif tayini için kullanılabilen klasik girişim mikroskobu durumumuz vardır. mikroskobik nesneler.

girişim yansıması

Girişim kullanan ek bir teknik, girişim yansıma mikroskobudur (yansıtılmış girişim kontrastı veya RIC olarak da bilinir). Bir girişim sinyali üretmek için slayta hücre yapışmasına dayanır. Cama bağlı hücre yoksa parazit olmaz.

Girişim yansıma mikroskobu, DIC tarafından kullanılan aynı elemanlar kullanılarak, ancak prizmalar olmadan elde edilebilir. Ayrıca, algılanan ışık, DIC kullanıldığında olduğu gibi yansıtılır ve iletilmez.

floresan

Görüntüler ayrıca eserler içerebilir . Bu bir odaklı lazer tarama floresan mikrografı ve Thale tere Anter (bir kısmının stamen ). Resim, diğer şeylerin yanı sıra, anterin hemen altında güzel bir kırmızı akan yaka benzeri yapı gösteriyor. Bununla birlikte, bozulmamış bir tere ercikinin böyle bir yakası yoktur, bu bir sabitleme artefaktıdır: ercik resim çerçevesinin altında kesilmiş ve ercik sapının epidermisi (hücrelerin üst tabakası) soyularak karakteristik olmayan bir yapı oluşturmuştur. . Fotoğraf: Tallinn Teknoloji Üniversitesi'nden Heiti Paves .

Bazı bileşikler yüksek enerjili ışıkla aydınlatıldıklarında daha düşük frekanslı ışık yayarlar. Bu etki floresan olarak bilinir . Genellikle numuneler , kimyasal yapılarına bağlı olarak karakteristik otofloresan görüntülerini gösterir .

Bu yöntem, tek moleküllerin saptanmasına izin vererek son derece hassas olabildiğinden, modern yaşam bilimlerinde kritik öneme sahiptir. Farklı yapıları veya kimyasal bileşikleri boyamak için birçok farklı floresan boya kullanılabilir. Özellikle güçlü bir yöntem, immün boyamada olduğu gibi bir floroforla birleştirilmiş antikorların kombinasyonudur . Yaygın olarak kullanılan floroforların örnekleri floresein veya rodamindir .

Antikorlar, bir kimyasal bileşik için özel olarak hazırlanabilir. Örneğin, sıklıkla kullanılan bir strateji, genetik koda (DNA) dayalı yapay protein üretimidir. Bu proteinler daha sonra proteine ​​bağlanan antikorlar oluşturarak tavşanları bağışıklamak için kullanılabilir. Antikorlar daha sonra kimyasal olarak bir floroforla birleştirilir ve incelenen hücrelerdeki proteinleri izlemek için kullanılır.

Yeşil floresan protein (GFP) gibi yüksek verimli floresan proteinler , floresan bileşiğinin ekspresyonunu hedef proteininkine bağlayan bir süreç olan gen füzyonunun moleküler biyoloji tekniği kullanılarak geliştirilmiştir . Bu birleşik floresan protein, genel olarak organizma için toksik değildir ve incelenen proteinin işlevine nadiren müdahale eder. Genetiği değiştirilmiş hücreler veya organizmalar, orijinal proteinin işlevinin in vivo çalışılmasını sağlayan floresan etiketli proteinleri doğrudan eksprese eder .

Protein kristallerinin büyümesi hem protein hem de tuz kristalleri ile sonuçlanır. Her ikisi de renksiz ve mikroskobiktir. Protein kristallerinin geri kazanılması, proteinin içsel floresansı veya transmisyon mikroskobu kullanılarak yapılabilen görüntüleme gerektirir. Protein 280 nm'de ışığı emdiği için her iki yöntem de bir ultraviyole mikroskobu gerektirir. Protein ayrıca 280 nm ışıkla uyarıldığında yaklaşık 353 nm'de floresan olacaktır.

Yana floresans emisyon olarak farklılık dalga uyarı ışığı, bir yere floresan görüntü gösterir floresan boya ile etiketlenmiştir sadece ilgi dahilindeki yapısından (renkli). Bu yüksek özgüllük, biyomedikal araştırmalarda floresan ışık mikroskobunun yaygın olarak kullanılmasına yol açtı. Farklı biyolojik yapıları boyamak için farklı floresan boyalar kullanılabilir, bunlar daha sonra aynı anda tespit edilebilirken, boyanın bireysel rengi nedeniyle hala spesifiktir.

Uyarı ışığının gözlemciye veya dedektöre ulaşmasını engellemek için yüksek kaliteli filtre setlerine ihtiyaç vardır. Bunlar tipik olarak , uyarma dalga boyları aralığını seçen bir uyarma filtresi , bir dikroik ayna ve uyarma ışığını bloke eden bir emisyon filtresinden oluşur. Çoğu floresan mikroskop , dedektöre giren uyarma ışığı miktarını daha da azaltmak için Epi-aydınlatma modunda (örneğin bir tarafından aydınlatma ve algılama) çalıştırılır.

Ayrıca bakınız: toplam iç yansıma floresan mikroskobu Sinirbilim

konfokal

Konfokal lazer tarama mikroskopisi, flüoresansı noktadan noktaya şekilde uyarmak için numune boyunca taranan odaklanmış bir lazer ışını (örn. 488 nm) kullanır . Yayılan ışık, odak dışı ışığın dedektöre, tipik olarak bir fotoçoğaltıcı tüpe ulaşmasını önlemek için bir iğne deliğinden yönlendirilir . Görüntü, uyarma lazerinin konumuna göre ölçülen floresan yoğunluklarını çizerek bir bilgisayarda oluşturulur. Tam numune aydınlatması ile karşılaştırıldığında, konfokal mikroskopi biraz daha yüksek yanal çözünürlük sağlar ve optik kesiti (eksenel çözünürlük) önemli ölçüde iyileştirir . Bu nedenle konfokal mikroskopi, 3D yapının önemli olduğu yerlerde yaygın olarak kullanılır.

Konfokal mikroskopların bir alt sınıfı , numune boyunca aynı anda birden fazla noktayı tarayabilen dönen disk mikroskoplardır . İğne delikleri olan ilgili bir disk, odak dışı ışığı reddeder. Dönen bir disk mikroskobundaki ışık detektörü, tipik olarak EM-CCD veya sCMOS olan bir dijital kameradır .

İki foton mikroskopisi

İki fotonlu bir mikroskop aynı zamanda bir lazer taramalı mikroskoptur, ancak uyarma için UV, mavi veya yeşil lazer ışığı yerine darbeli bir kızılötesi lazer kullanılır. Yalnızca lazerin küçük odağında yoğunluk, iki foton uyarımı ile flüoresans üretecek kadar yüksektir , bu da odak dışı flüoresans üretilmediği ve görüntüyü temizlemek için iğne deliği gerekmediği anlamına gelir. Bu, konfokal bir mikroskobun fotonları verimli bir şekilde toplayamayacağı saçılma dokusunun derinliklerinde görüntülemeye izin verir. Geniş alan algılamalı iki foton mikroskoplar , beyin dokusunda örneğin kalsiyum görüntüleme gibi fonksiyonel görüntüleme için sıklıkla kullanılır . 2 foton uyarımı yerine 3-foton kullanmanın kazanımları marjinal olsa da, birkaç şirket tarafından Multiphoton mikroskopları olarak pazarlanmaktadırlar .

Tek düzlem aydınlatma mikroskobu ve ışık levha floresan mikroskobu

Silindirik bir mercekten ışığı dar bir açıyla odaklayarak veya objektif eksenine dik bir düzlemde bir ışık çizgisi tarayarak oluşturulan bir ışık düzlemi kullanılarak yüksek çözünürlüklü optik kesitler alınabilir. Tek düzlem aydınlatması veya hafif levha aydınlatması, çoklu prizma ışın genişleticileri içeren ışın şekillendirme teknikleri kullanılarak da gerçekleştirilir . Görüntüler CCD'ler tarafından yakalanır. Bu varyantlar çok hızlı ve yüksek sinyal-gürültü oranlı görüntü yakalamaya izin verir.

Geniş alan multifoton mikroskopisi

Geniş alan multifoton mikroskopisi , nesnenin geniş bir alanının taramaya gerek kalmadan aydınlatıldığı ve görüntülendiği optik doğrusal olmayan bir görüntüleme tekniğini ifade eder . İki foton floresan veya ikinci harmonik üretim gibi doğrusal olmayan optik süreçleri indüklemek için yüksek yoğunluklar gerekir . Gelen multiphoton mikroskopları tarayarak yüksek şiddetler sıkıca ışık odaklanarak elde edilir ve görüntü huzme tarama ile elde edilir. Olarak geniş alan mikroskopi multiphoton yüksek yoğunlukları, en iyi şekilde kullanarak elde edilmiştir , optik olarak amplifiye geniş bir görüş alanı (~ 100 um) elde etmek için darbeli lazer kaynağı. Bu durumda görüntü, taramaya ihtiyaç duymadan bir CCD kamera ile tek bir kare olarak elde edilir, bu da tekniği, ilgilenilen nesne boyunca aynı anda dinamik süreçleri görselleştirmek için özellikle kullanışlı hale getirir. Geniş alanlı çok fotonlu mikroskopi ile kare hızı, çok fotonlu tarama mikroskobuna kıyasla 1000 kata kadar artırılabilir . Ancak saçılan dokuda görüntü kalitesi artan derinlikle hızla düşer.

dekonvolüsyon

Floresan mikroskobu, karmaşık bir ortamda özel olarak etiketlenmiş yapıları göstermek ve biyolojik yapıların üç boyutlu bilgisini sağlamak için güçlü bir tekniktir. Bununla birlikte, bu bilgi, aydınlatma üzerine, odakta olsun ya da olmasın, tüm floresan etiketli yapıların ışık yayması gerçeğiyle bulanıklaşır. Bu nedenle, belirli bir yapının görüntüsü, odak dışında kalan yapılardan gelen ışığın katkısıyla her zaman bulanıklaşır. Bu fenomen, özellikle yüksek çözme gücüne sahip hedefler, tipik olarak yüksek sayısal açıklığa sahip yağa batırma hedefleri kullanıldığında kontrast kaybına neden olur.

Darbeli THz lazer görüntüleme sisteminin matematiksel olarak modellenmiş Nokta Yayılım İşlevi.

Bununla birlikte, bulanıklığa ışık saçılması gibi rastgele süreçler neden olmaz, ancak mikroskop görüntüleme sistemindeki görüntü oluşumunun optik özellikleri ile iyi tanımlanabilir. Küçük bir floresan ışık kaynağı (esas olarak parlak bir nokta) düşünülürse, bu noktadan gelen ışık, nokta daha fazla odak dışı hale geldikçe bizim bakış açımızdan daha uzağa yayılır. İdeal koşullar altında bu , üçüncü (eksenel) boyutta bu nokta kaynağının bir "kum saati" şeklini oluşturur . Bu şekil, mikroskop görüntüleme sisteminin nokta yayılma fonksiyonu (PSF) olarak adlandırılır . Herhangi bir flüoresan görüntüsü, çok sayıda bu tür küçük flüoresan ışık kaynağından oluştuğu için, görüntünün "nokta yayma işlevi tarafından kıvrıldığı" söylenir. Bir terahertz lazer darbeli görüntüleme sisteminin matematiksel olarak modellenmiş PSF'si sağda gösterilmektedir.

Bir görüntüleme sisteminin çıktısı aşağıdaki denklem kullanılarak tanımlanabilir:

Burada n, katkı gürültüsüdür. Bu nokta yayılma işlevini bilmek, bu işlemi, yaygın olarak dekonvolüsyon mikroskobu olarak bilinen bilgisayar tabanlı yöntemlerle belirli bir dereceye kadar tersine çevirmenin mümkün olduğu anlamına gelir . 2B veya 3B dekonvolüsyon için çeşitli algoritmalar mevcuttur. Kabaca restoratif olmayan ve restoratif yöntemler olarak sınıflandırılabilirler . Restoratif olmayan yöntemler odak dışı ışığı odak düzlemlerinden kaldırarak kontrastı iyileştirebilirken, yalnızca restoratif yöntemler ışığı asıl kaynağına yeniden atayabilir. Floresan görüntüleri bu şekilde işlemek , eş odaklı mikroskopiden alınan görüntüler gibi odak dışı ışık olmadan doğrudan görüntü elde etmeye göre bir avantaj olabilir , çünkü aksi takdirde ortadan kaldırılan ışık sinyalleri yararlı bilgiler haline gelir. 3D ters evrişim için, tipik olarak, farklı odak düzlemlerinden (Z-yığını olarak adlandırılır) alınan bir dizi görüntü ve ayrıca mikroskobun tüm katkıda bulunan parametrelerinin bilinmesinden deneysel veya teorik olarak türetilebilen PSF bilgisi sağlanır.

Alt kırınım teknikleri

Süper çözünürlüklü mikroskopi örneği. Resmi HER3 ve Her2 , hedefi meme kanseri ilacı Trastuzumab bir kanser hücre içinde.

Son zamanlarda, kırınım sınırını aşan çok sayıda süper çözünürlüklü mikroskopi tekniği geliştirilmiştir .

Bu, çoğunlukla, yeterince statik bir numuneyi birden çok kez görüntüleyerek ve uyarma ışığını değiştirerek veya görüntüdeki stokastik değişiklikleri gözlemleyerek elde edilir. Bir pikselin değerinin ne anlama geldiği konusunda biraz farklı bir anlayışla da olsa, önceki bölümde açıklanan, PSF kaynaklı bulanıklığı ortadan kaldıran ve matematiksel olarak 'doğru' bir ışık kaynağı atayan dekonvolüsyon yöntemleri kullanılır. Çoğu zaman , tek bir floroforun, alınan tek bir görüntüdeki tek bir lekeye katkıda bulunduğu varsayılırsa , görüntülerdeki lekeler, hesaplanan konumlarıyla değiştirilebilir, bu da çözünürlüğü büyük ölçüde kırınım sınırının çok altına iyileştirir.

Böyle bir varsayımı gerçekleştirmek için, düzenli olarak ~20 nanometre çözünürlüklerin elde edildiği bu tekniklerin merkezinde florofor fotofiziğinin bilgisi ve kimyasal kontrolü yer alır.

Seri zaman kodlu güçlendirilmiş mikroskopi

Seri zaman mikroskobu (buhar) temel ödünleşimi duyarlılık ve hız ve tek piksel arası atlatmak için optik görüntü amplifikasyonu kullanılarak, çok hızlı obtüratör hızı ve kare hızını sağlayan bir görüntüleme yöntemi amplifiye kodlanmış fotodetektör a gereksinimini ortadan kaldırmak için dedektör dizisi ve okuma süresi sınırlamaları Yöntem, son teknoloji CCD ve CMOS kameralardan en az 1000 kat daha hızlıdır . Sonuç olarak, şok dalgalarının, mikroakışkanların , MEMS'in ve lazer cerrahisinin gerçek zamanlı teşhisi ve değerlendirilmesi dahil olmak üzere, yüksek görüntü elde etme oranları gerektiren çok çeşitli bilimsel, endüstriyel ve biyomedikal uygulamalar için potansiyel olarak yararlıdır .

Uzantılar

Çoğu modern enstrüman, mikro fotoğrafçılık ve elektronik olarak görüntü kaydı için basit çözümler sunar. Bununla birlikte, bu tür yetenekler her zaman mevcut değildir ve daha deneyimli mikroskop uzmanları, çoğu durumda, yine de elle çizilmiş bir görüntüyü bir fotoğrafa tercih edecektir. Bunun nedeni, konunun bilgisine sahip bir mikroskopistin, üç boyutlu bir görüntüyü hassas bir iki boyutlu çizime doğru bir şekilde dönüştürebilmesidir. Ancak bir fotoğrafta veya başka bir görüntü yakalama sisteminde, yalnızca bir ince düzlem iyi odaktadır.

Dikkatli ve doğru mikrografların oluşturulması, monoküler bir mercek kullanan mikroskobik bir teknik gerektirir. Her iki gözün de açık olması ve mikroskobu gözlemlemeyen gözün bunun yerine mikroskobun yanında bankın üzerindeki bir kağıt yaprağına konsantre olması esastır. Pratikle ve baş veya gözleri hareket ettirmeden, mikroskobik görüntüdeki kalem noktasını aynı anda "görerek" gözlenen şekillerin etrafını çizerek gözlemlenen ayrıntıları doğru bir şekilde kaydetmek mümkündür.

Bu tekniği uygulamak aynı zamanda iyi bir genel mikroskobik tekniği de ortaya çıkarır. Görüntünün sonsuzda ve her zaman iki göz açık olarak görülebilmesi için mikroskop odaklı gözlem yapmak her zaman daha az yorucudur.

Diğer geliştirmeler

Mikrospektroskopi: mikroskopla spektroskopi

Röntgen

Çözünürlük ışığın dalga boyuna bağlı olduğundan. Elektron mikroskobu 1930'lardan beri ışık yerine elektron ışınları kullanan geliştirilmiştir. Elektron demetinin çok daha küçük dalga boyundan dolayı çözünürlük çok daha yüksektir.

Daha az yaygın olmasına rağmen, X-ışını mikroskobu da 1940'ların sonlarından beri geliştirilmiştir. X-ışını mikroskobunun çözünürlüğü, ışık mikroskobu ile elektron mikroskobunun çözünürlüğü arasındadır.

Elektron mikroskobu

Alt kırınım mikroskobunun icadına kadar, ışığın dalga boyu geleneksel mikroskopinin çözünürlüğünü yaklaşık 0,2 mikrometre ile sınırladı. Daha yüksek çözünürlük elde etmek için elektron mikroskoplarında çok daha küçük dalga boyuna sahip bir elektron ışını kullanılır.

  • Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), örneğin çok ince bir diliminden bir elektron ışını göndererek bileşik ışık mikroskobuna oldukça benzer. 2005 yılında çözünürlük sınırı 0,05 nanometre civarındaydı ve o zamandan beri kayda değer bir artış olmadı.
  • Taramalı elektron mikroskobu (SEM), numunelerin yüzeylerindeki detayları görselleştirir ve çok güzel bir 3D görünüm sağlar. Stereo ışık mikroskobununkine çok benzer sonuçlar verir. 2011 yılında SEM için en iyi çözünürlük 0.4 nanometre idi.

X-ışını spektroskopisi için donatılmış elektron mikroskopları , kalitatif ve kantitatif element analizi sağlayabilir. Analitik elektron mikroskobu olarak da bilinen bu tip elektron mikroskobu, nanomalzemelerin araştırılması için çok güçlü bir karakterizasyon aracı olabilir.

Taramalı sonda mikroskobu

Bu bir alt kırınım tekniğidir. Taramalı prob mikroskoplarının örnekleri, atomik kuvvet mikroskobu (AFM), Taramalı tünelleme mikroskobu , fotonik kuvvet mikroskobu ve tekrarlama izleme mikroskobudur . Tüm bu yöntemler, neredeyse düz olması gereken bir nesnenin yüzeyini taramak için katı bir prob ucunun fiziksel temasını kullanır.

ultrasonik kuvvet

Ultrasonik kuvvet mikroskobu (UFM), AFM görüntülerinin kontrast açısından sınırlı olduğu "düz" ilgi alanlarında ayrıntıları ve görüntü kontrastını iyileştirmek için geliştirilmiştir. AFM-UFM kombinasyonu, yakın alan akustik mikroskobik görüntünün oluşturulmasına izin verir. AFM ucu, ultrasonik dalgaları algılamak için kullanılır ve akustik mikroskopide oluşan dalga boyu sınırlamasının üstesinden gelir. AFM ucunun altındaki elastik değişiklikleri kullanarak, AFM topografyasından çok daha detaylı bir görüntü oluşturulabilir.

Ultrasonik kuvvet mikroskobu , konsola veya numuneye ultrasonik titreşim uygulanmasıyla atomik kuvvet mikroskobunda elastikliğin yerel haritalanmasına izin verir . Ultrasonik kuvvet mikroskobu sonuçlarını nicel olarak analiz etmek amacıyla, konsol tabanına uygulanan ultrasonik titreşim ile bir kuvvet-mesafe eğrisi ölçümü yapılır ve sonuçlar, konsol dinamiği ve uç-numune etkileşimi modeliyle karşılaştırılır. sonlu farklar tekniğine dayanmaktadır.

ultraviyole mikroskopisi

Ultraviyole mikroskopların iki ana amacı vardır. Birincisi, standart optik mikroskopların kırınım sınırının ötesinde görüntü çözünürlüğünü geliştirmek için daha kısa ultraviyole elektromanyetik enerji dalga boyunu kullanmaktır. Bu teknik, modern yarı iletkenlerde bulunanlar gibi çok küçük özelliklere sahip cihazların tahribatsız muayenesi için kullanılır. UV mikroskopları için ikinci uygulama, ışığın numunenin içindeki moleküllerle etkileşimi nedeniyle, çevrelerine göre tek tek numunelerin tepkisinin arttırıldığı kontrast geliştirmedir. Bir örnek, protein kristallerinin büyümesidir . Tuz çözeltilerinde protein kristalleri oluşur. Tuz ve protein kristallerinin her ikisi de büyüme sürecinde oluştuğundan ve her ikisi de genellikle insan gözü için şeffaf olduğundan, standart bir optik mikroskopla ayırt edilemezler. De triptofan ve protein 280 nm'de ışık absorbe eder, 280 nm, bant geçirici filtrelerin bir UV mikroskop ile görüntüleme basit kristaller olarak iki farklı kılar. Tuz kristalleri şeffafken protein kristalleri koyu görünür.

Kızılötesi mikroskopi

Terimi, kızılötesi mikroskopi gerçekleştirilir Mikroskopi belirtir kızılötesi dalga boyu. Tipik cihaz konfigürasyonunda, bir Fourier Dönüşümü Kızılötesi Spektrometresi (FTIR), bir optik mikroskop ve bir kızılötesi detektör ile birleştirilir . Kızılötesi dedektör, tek nokta dedektörü, doğrusal dizi veya 2D odak düzlemi dizisi olabilir. FTIR, kızılötesi spektroskopi yoluyla kimyasal analiz yapma yeteneği sağlar ve mikroskop ve nokta veya dizi detektörü, bu kimyasal analizin uzamsal olarak çözülmesini, yani örneğin farklı bölgelerinde gerçekleştirilmesini sağlar. Bu nedenle, teknik aynı zamanda kızılötesi mikrospektroskopi olarak da adlandırılır. Lazer Doğrudan Kızılötesi (LDIR) Görüntüleme olarak adlandırılan alternatif bir mimari , ayarlanabilir bir kızılötesi ışık kaynağı ile uçan bir hedef üzerinde tek nokta dedektörünün kombinasyonunu içerir). Bu teknik, görüntü kontrastının, kullanıcı tarafından seçilen belirli IR dalga boylarına, genellikle spesifik IR absorpsiyon bantlarına ve ilişkili moleküler rezonanslara bireysel numune bölgelerinin tepkisi ile belirlendiği kızılötesi kimyasal görüntüleme için sıklıkla kullanılır . Konvansiyonel kızılötesi mikrospektroskopinin önemli bir sınırlaması, uzaysal çözünürlüğün kırınım sınırlı olmasıdır . Spesifik olarak uzaysal çözünürlük, ışığın dalga boyu ile ilgili bir rakamla sınırlıdır. Pratik IR mikroskoplar için, uzaysal çözünürlük, kullanılan spesifik tekniğe ve alete bağlı olarak dalga boyunun 1-3 katı ile sınırlıdır. Orta IR dalga boyları için bu, ~3-30 μm'lik pratik bir uzaysal çözünürlük limiti belirler.

Alt kırınım mikroskobunun IR versiyonları da mevcuttur. Bunlara IR Yakın alan taramalı optik mikroskop (NSOM) , fototermal mikrospektroskopi ve atomik kuvvet mikroskobu tabanlı kızılötesi spektroskopi (AFM-IR) ile saçılma tipi Taramalı Yakın Alan Optik Mikroskobu (s-SNOM) ve nano-FTIR dahildir . IR dalga boylarında nano ölçekli uzaysal çözünürlük sağlar.

Dijital holografik mikroskopi

DHM faz kayması (solda) ve faz kontrast mikroskobu (sağda) ile görüntülenen insan hücreleri .

Olarak dijital holografik mikroskobu (DHM), müdahale dalga önleri bir mesafede Coherent (monokromatik) ışık kaynaklı bir sensör ile kaydedilir. Görüntü, kaydedilen hologramdan bir bilgisayar tarafından dijital olarak yeniden oluşturulur . Sıradan parlak alan görüntüsünün yanı sıra bir faz kayması görüntüsü oluşturulur.

DHM hem yansıma hem de iletim modunda çalışabilir. Yansıma modunda, faz kayması görüntüsü nispi bir mesafe ölçümü sağlar ve dolayısıyla yansıtıcı yüzeyin bir topografya haritasını temsil eder . İletim modunda, faz kayması görüntüsü, numunenin optik kalınlığının etiketsiz nicel bir ölçümünü sağlar. Biyolojik hücrelerin faz kayması görüntüleri, boyanmış hücrelerin görüntülerine çok benzer ve yüksek içerikli analiz yazılımı tarafından başarıyla analiz edilmiştir .

DHM'nin benzersiz bir özelliği, tüm odak düzlemleri hologram tarafından aynı anda kaydedildiğinden, görüntü kaydedildikten sonra odağı ayarlama yeteneğidir. Bu özellik, bir hacimdeki hareketli parçacıkların görüntülenmesini veya bir yüzeyin hızla taranmasını mümkün kılar. Bir başka çekici özellik de, DHM'nin yazılımla optik sapmaları düzelterek düşük maliyetli optikleri kullanabilme yeteneğidir.

Dijital patoloji (sanal mikroskopi)

Dijital patoloji, dijital bir slayttan üretilen bilgilerin yönetimine izin veren bilgisayar teknolojisi tarafından etkinleştirilen görüntü tabanlı bir bilgi ortamıdır. Dijital patoloji, kısmen , cam slaytları görüntülenebilen, yönetilebilen ve analiz edilebilen dijital slaytlara dönüştürme uygulaması olan sanal mikroskopi ile etkinleştirilir .

lazer mikroskopisi

Lazer mikroskopi, çeşitli mikroskopi biçimlerinde lazer aydınlatma kaynaklarını kullanan, hızla büyüyen bir alandır. Örneğin, biyolojik uygulamalara odaklanan lazer mikroskopi , doğrusal olmayan mikroskopi, doygunluk mikroskobu ve iki foton uyarma mikroskobu olarak etiketlenen bir dizi teknikte ultra kısa darbeli lazerler kullanır .

Yüksek yoğunluklu, kısa darbeli laboratuvar röntgen lazerleri birkaç yıldır geliştirilmektedir. Bu teknoloji meyvesini verdiğinde, canlı durumdaki temel biyolojik yapıların büyütülmüş üç boyutlu görüntülerini kesin olarak tanımlanmış bir anda elde etmek mümkün olacaktır. Su ve protein arasındaki optimum kontrast ve en iyi hassasiyet ve çözünürlük için lazer, nitrojen çizgisinin yakınında yaklaşık 0,3 nanometre olarak ayarlanmalıdır. Çözünürlük esas olarak gerekli sayıda foton kaydedilirken meydana gelen hidrodinamik genişleme ile sınırlı olacaktır. Böylece numune maruz kalma nedeniyle yok olurken, konfigürasyonu patlamadan önce yakalanabilir.

Bilim adamları, uygun lazerin uzun süredir geliştirilmesine rağmen, x-ışını holografik mikroskopları için pratik tasarımlar ve prototipler üzerinde çalışıyorlar.

foto akustik mikroskopi

Fotoakustik etkiye dayanan bir mikroskopi tekniği , yani ışık absorpsiyonunun neden olduğu (ultra) ses üretimi. Odaklanmış ve yoğunluğu modüle edilmiş bir lazer ışını, bir numune üzerinde raster taranır. Üretilen (ultra) ses, bir ultrason dönüştürücü aracılığıyla algılanır. Genellikle piezoelektrik ultrason dönüştürücüler kullanılır.

Görüntü kontrastı, numunenin absorpsiyon katsayısı ile ilgilidir . Bu, görüntü kontrastının geçirgenlik veya saçılmadan kaynaklandığı parlak veya karanlık alan mikroskobunun aksinedir. Prensipte, floresan mikroskopisinin kontrastı da numunenin absorpsiyonu ile orantılıdır. Bununla birlikte, floresan mikroskobunda, bir sinyalin tespit edilebilmesi için floresan kuantum veriminin sıfıra eşit olmaması gerekir. Fotoakustik mikroskopide ise, her soğurucu madde ile orantılı olan bir fotoakustik sinyal verir .

İşte Grüneisen katsayısı, lazerin foton enerjisi ve örneğin bant aralığı enerjisidir. Bu nedenle, yüksek bir flüoresans kuantum verimi yüksek flüoresans sinyallerine yol açtığından ve düşük bir flüoresans kuantum verimi yüksek foto akustik sinyallere yol açtığından, fotoakustik mikroskopi, flüoresans mikroskobu için tamamlayıcı bir teknik olarak çok uygun görünmektedir.

Doğrusal olmayan etkileri ihmal ederek, yanal çözünürlük dx , Abbe kırınım limiti ile sınırlıdır :

burada uyarma lazerinin dalga boyu ve NA , objektif lensin sayısal açıklığıdır. Abbe kırınım limiti, gelen dalga cephesi paralel ise geçerlidir. Ancak gerçekte lazer ışını profili Gauss'tur. Bu nedenle, ulaşılabilir çözünürlüğü hesaplamak için, kesik Gauss kirişleri için formüller kullanılmalıdır.

amatör mikroskopi

Amatör Mikroskopi , biyolojik ve biyolojik olmayan örneklerin eğlence amaçlı araştırılması ve gözlemlenmesidir . Mineraller , böcekler , deniz kabukları ve bitki toplayıcıları, topladıkları öğeleri sınıflandırmalarına yardımcı olan özellikleri ortaya çıkarmak için mikroskopları araç olarak kullanabilir . Diğer amatörler, gölet suyunda ve diğer örneklerde bulunan yaşamı gözlemlemekle ilgilenebilirler. Mikroskoplar, evlerinde akvaryum bulunduran kişilerin su kalitesi değerlendirmesi için de faydalı olabilir . Fotoğrafik dokümantasyon ve mikroskobik görüntülerin çizimi, amatörlerin görev yelpazesini artıran ek görevlerdir. Fotomikrograf sanatı için yarışmalar bile var . Bu eğlencenin katılımcıları, ticari olarak hazırlanmış mikroskobik slaytları kullanabilir veya numune hazırlama görevine katılabilir.

Mikroskopi, biyolojik örneklerin belgelenmesinde merkezi bir araç olsa da, genel olarak, yalnızca mikroskobik araştırmalara dayalı olarak yeni bir türün tanımını doğrulamak için yetersizdir. Yeni bir türün keşfini doğrulamak için genellikle genetik ve biyokimyasal testler gereklidir. Bir laboratuvar ve akademik literatüre erişim, uzmanlaşmış ve genel olarak amatörler için mevcut olmayan bir zorunluluktur. Ancak amatörlerin profesyonellere göre büyük bir avantajı vardır: çevrelerini keşfetme zamanı. Çoğu zaman, ileri düzey amatörler, bulgularını doğrulamak ve (muhtemelen) yeni türleri tanımlamak için profesyonellerle bir araya gelir.

1800'lerin sonlarında amatör mikroskopi, Amerika Birleşik Devletleri ve Avrupa'da popüler bir hobi haline geldi. Birkaç 'profesyonel amatör', Pazar öğleden sonra onları eğlendirmek için hayırseverler tarafından numune alma gezileri ve mikroskobik keşifler için para alıyordu (örneğin, diatom uzmanı A. Grunow, (diğerlerinin yanı sıra) Belçikalı bir sanayici tarafından ödeniyordu). Profesör John Phin "Mikroskobun Seçimi ve Kullanımına İlişkin Pratik İpuçları (İkinci Baskı, 1878)" yayınladı ve aynı zamanda "Amerikan Mikroskop Dergisi"nin editörüydü.

Amatör mikroskopi görüntülerine örnekler:

Adli bilimlerde uygulama

Mikroskopinin adli bilimlerde birçok uygulaması vardır; sonuçların kesinliğini, kalitesini, doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar. Bu uygulamalar neredeyse sınırsızdır. Bunun nedeni, mikroskobun en küçük kanıt öğelerini genellikle herhangi bir değişiklik veya imha olmaksızın algılama, çözme ve görüntüleme yeteneğidir. Mikroskop, lifleri, kılları, kirleri ve tozu vb. tanımlamak ve karşılaştırmak için kullanılır.

Herhangi bir mikroskobun amacı, küçük bir nesnenin görüntülerini veya fotoğraflarını büyütmek ve ince ayrıntıları görmektir. adli tıpta; numunenin tipi, ondan elde etmek istenen bilgiler ve görev için seçilen mikroskop tipi numune hazırlamanın gerekli olup olmadığını belirleyecektir. Örneğin, mürekkep çizgileri, kan lekeleri veya mermiler, herhangi bir işleme gerek yoktur ve kanıtlar herhangi bir numune hazırlama şekli olmadan doğrudan uygun mikroskoptan gösterilir, ancak belirli madde izleri için numune hazırlama, mikroskobik inceleme gerçekleşmeden önce yapılmalıdır.

Adli tıp laboratuvarında çeşitli mikroskoplar kullanılmaktadır. Işık mikroskopları adli tıpta en çok kullanılanlardır ve bu mikroskoplar görüntüleri oluşturmak için fotonları kullanır 4 , daha önce bahsedildiği gibi adli örneklerin incelenmesi için en uygun olan bu mikroskoplar aşağıdaki gibidir:

1. Bileşik mikroskop

2. Karşılaştırma mikroskobu

3. Stereoskopik mikroskop

4. Polarize mikroskop

5. Mikro spektrofotometre

Adli tıp uygulamalarında mikroskop türlerinin bu çeşitliliği, esas olarak optik mikroskopi için sırasıyla (1-1200X), (50-30.000X) ve (500- 250.000X) olan büyütme aralıklarından, SEM ve TEM'den kaynaklanmaktadır.

Ayrıca bakınız

Referanslar

daha fazla okuma

Dış bağlantılar

Genel
teknikler