Lazer yakalama mikro diseksiyonu - Laser capture microdissection

Saf meme kanalı epitel hücrelerinin lazer yakalama mikro diseksiyon transferi . Sol panel, seçilen hücrelerin çıkarıldığı doku bölümünü gösterir. Sağ panel, transfer filmi üzerindeki izole epitel hücrelerini gösterir.

Lazer yakalama mikrodiseksiyon ( LCM ) olarak da adlandırılır mikrodiseksiyon , lazer mikrodisseksiyon ( LMD ) veya lazerli mikrodisseksiyon ( LMD veya LAM ), belirli bir izole edilmesi için bir yöntem hücrelerin mikroskobik bölgelere ilgilenilen doku / hücre / organizmalar ( diseksiyon A bir lazer yardımıyla mikroskobik ölçek ).

Prensip

Lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM), doğrudan mikroskobik görüntüleme altında doku hücrelerinin alt popülasyonlarını elde etmek için bir yöntemdir. LCM teknolojisi, ilgili hücreleri doğrudan hasat edebilir veya histolojik olarak saf zenginleştirilmiş hücre popülasyonları vermek için istenmeyen hücreleri keserek spesifik hücreleri izole edebilir. Çeşitli aşağı akış uygulamaları mevcuttur: DNA genotipleme ve heterozigotluk kaybı (LOH) analizi, RNA transkript profili, cDNA kütüphanesi oluşturma, proteomik keşfi ve sinyal yolu profili. Bu protokolü gerçekleştirmek için gereken toplam süre tipik olarak 1–1,5 saattir.

çıkarma

Bir lazer mikroskopla birleştirilir ve slayttaki dokuya odaklanır. Lazerin optik veya sahne tarafından hareket ettirilmesi ile odak, kullanıcı tarafından önceden tanımlanan bir yörünge izler. Öğe olarak da adlandırılan bu yörünge, daha sonra kesilir ve bitişik dokudan ayrılır. Kesme işleminden sonra, bir ekstraksiyon işlemi isteniyorsa, bir ekstraksiyon işlemi takip etmelidir. Daha yeni teknolojiler temassız mikro diseksiyon kullanır.

Üzerinde histopatoloji örneği bulunan bir mikroskop lamından doku çıkarmanın birkaç yolu vardır . Numune üzerine yapışkan bir yüzeye bastırın ve yırtın. Bu, istenen bölgeyi çıkarır, ancak yüzey seçici olmadığı için yüzeydeki partikülleri veya istenmeyen dokuları da çıkarabilir. Numune üzerine plastik bir membran eritin ve yırtın. Isı, örneğin bir kırmızı veya kızılötesi (IR) lazer ile bir emici boya ile boyanmış bir zar üzerine verilir. Bu, istenen numuneyi zar üzerine yapıştırdığından, histopatoloji numune yüzeyine yakın yerleştirilen herhangi bir zarda olduğu gibi, bir miktar kalıntı ekstrakte edilebilir. Diğer bir tehlike de sokulan ısıdır: DNA, RNA veya protein gibi bazı moleküller, mümkün olduğunca saf bir şekilde izole edilmek amacıyla çok fazla veya hiç ısıtılmasına izin vermez.

Temassız taşıma için. Üç farklı yaklaşım var. Nakliyat ağırlık dik bir mikroskop (denilen GAM kullanılarak yerçekimi-destekli mikrodiseksiyon ile) ya da taşıma lazer basınç Tasarımımın ; en son nesil, lazerle indüklenen ileri aktarıma (LIFT) dayalı bir teknoloji kullanmaktadır . Kes-ve-yakala ile, yapışkanla kaplanmış bir kapak doğrudan ince kesilmiş (5-8 μm) doku bölümü üzerine yerleştirilir, bölümün kendisi ince bir zar (polietilen naftalen) üzerinde durur. Bir IR lazer, kapaktaki yapışkanı, alttaki dokuya kaynaştırarak hafifçe ısıtır ve bir UV lazer, doku ve alttaki zarı keser. Membran-doku varlığı artık kapağa yapışır ve kapak üzerindeki hücreler aşağı akış uygulamalarında (DNA, RNA, protein analizi) kullanılabilir.

Prosedür

Lazer Yakalama Mikrodiseksiyonu

Bir yazılım arayüzü kullanan bir mikroskop altında , bir doku kesiti (tipik olarak 5-50 mikrometre kalınlığında) görüntülenir ve tek tek hücreler veya hücre kümeleri manuel olarak veya yarı otomatik veya daha tam otomatik yollarla tanımlanır ve görüntülemeye ve ardından otomatik seçim izolasyon için hedefler. Şu anda, hücre izolasyonu için bir mikroskop ve cihaz kullanan altı birincil izolasyon / toplama teknolojisi mevcuttur. Bunlardan dördü tipik olarak dokuların veya zarların / filmin kesilmesi için ultraviyole darbeli bir lazer (355 nm) ve bazen hücresel yapışma ve izolasyon için yapışkan bir polimerin ısıtılmasından / eritilmesinden sorumlu bir IR lazer ile kombinasyon halinde kullanır . IR lazer, mikrodiseksiyona daha nazik bir yaklaşım sağlar. Beşinci bir ultraviyole lazer tabanlı teknoloji, lazer darbesiyle etkinleştirildiğinde doku veya hücreleri bir toplama kapağına iten bir enerji transfer kaplaması ile kaplanmış özel slaytlar kullanır.

Lazer kesim genişliği genellikle 1 μm'den azdır, bu nedenle hedef hücreler lazer ışınından etkilenmez. Canlı hücreler bile lazer kesimden zarar görmez ve klonlama ve yeniden kültürleme için kesildikten sonra uygun şekilde kullanılabilir.

Çeşitli teknolojiler, toplama sürecinde, olası görüntüleme yöntemlerinde ( floresan mikroskobu / parlak alan mikroskobu / diferansiyel girişim kontrast mikroskobu / faz kontrast mikroskobu / vb.) Ve görüntüleme ve izolasyondan önce ihtiyaç duyulan tutucu tipleri ve doku hazırlığı bakımından farklılık gösterir . Çoğu öncelikle özel mikro diseksiyon sistemleridir ve bazıları araştırma mikroskopları olarak da kullanılabilir, yalnızca bir teknoloji (burada # 2, Leica) dik bir mikroskop kullanır ve özellikle canlı hücre çalışması için bazı örnek işleme yeteneklerini bir şekilde sınırlar.

İlk teknoloji (Carl Zeiss PALM tarafından kullanılan) numunenin etrafını keser ve ardından onu bir "mancınık" teknolojisi ile toplar. Numune, bazen Lazer Mikro-diseksiyon Basınçlı Mancınık (LMPC) olarak adlandırılan bir teknik olan slayt / tabaktan malzemeyi itmek için fotonik bir kuvvet oluşturan odaklanmamış bir UV lazer darbesi ile bir slayt veya özel kültür tabağından fırlatılabilir. Kesilen malzeme yukarı doğru (birkaç milimetreye kadar) bir mikrofüj tüp kapağına veya dokunun yapışacağı tüp kapağında bir tampon veya özel bir yapışkan malzeme içeren başka bir toplayıcıya gönderilir. Bu aktif mancınık süreci, membran kaplı slaytlar kullanılırken bazı statik sorunları ortadan kaldırır.

Başka bir işlem, kullanılan slaydın altındaki tüp kapağındaki numuneleri toplamak için yerçekimini etkinleştiren yerçekimi destekli mikrodiseksiyon yöntemini takip eder ( ION LMD sistemi, Jungwoo F&B tarafından kullanılır ). Bu sistem durumunda, lazer ışınını sabit tutarak ilgili hücreleri kesmek için motorlu sahneyi hareket ettirir. Ve sistem , dokuları RNA veya DNA hasarı olmadan kesmenin en güvenli yolu olan 355 nm Katı Hal lazeri ( UV-A ) kullanır .

Yakından ilişkili başka bir LCM işlemi (Leica tarafından kullanılan), numuneyi yukarıdan keser ve numune, yerçekimi (yerçekimi destekli mikro diseksiyon) yoluyla numunenin altındaki bir yakalama cihazına düşer. Üstteki farklı nokta, buradaki lazer ışını dikroik aynayı hareket ettirerek dokuyu kesmek için hareket ediyor.

Seçilen hücreler (slaytta veya özel kültür tabağında) görüş alanının merkezinde olduğunda, operatör alet yazılımını kullanarak ilgilenilen hücreleri seçer. Doku numunesi üzerine yerleştirilen bir kapak üzerindeki transfer filmini etkinleştirmek için IR'ye yakın bir lazerde izole edilecek alan, daha sonra filmi tercih edilen alttaki hücrelerle birleştiren yapıştırıcıyı erittiğinde (Arcturus sistemlerine bakınız); ve / veya ilgilenilen hücreyi kesip çıkarmak için bir UV lazeri aktive ederek. Hücreler daha sonra tüm istenmeyen hücreleri geride bırakarak ince doku bölümünden kaldırılır. İlgili hücreler daha sonra çıkarılmadan önce görüntülenir ve belgelenir.

Dördüncü UV tabanlı teknoloji (Molecular Machines and Industries AG tarafından kullanılan), esasen slayt> numune> ile bir sandviç türü oluşturarak ve membran yüzeyi olan bir çerçeve slaydı kullanarak numuneyi örten membran oluşturarak 3. teknolojiden küçük bir fark sunar. lazer tarafından kesilir ve nihayetinde özel bir yapışkan başlık ile yukarıdan alınır.

Beşinci bir UV bazlı teknoloji, inert bir enerji transfer kaplaması ve UV bazlı bir lazer mikro diseksiyon sistemi (tipik olarak bir Leica LMD veya PALM Zeiss makinesi) ile kaplanmış standart cam slaytları kullanır. Doku bölümleri, enerji transfer kaplamasının üstüne monte edilir. UV lazerden gelen enerji kaplamaya çarptığında kinetik enerjiye dönüştürülür, buharlaştırılır ve seçilen doku özelliklerini anında toplama tüpüne iter. Expression Pathology Inc. (Rockville, MD) tarafından DIRECTOR slaytları ticari adı altında ticarileştirilen enerji transfer kaplı slaytlar, proteomik çalışma için çeşitli avantajlar sunar. Ayrıca otofloresans yapmazlar, bu nedenle floresan lekeler, DIC veya polarize ışık kullanan uygulamalar için kullanılabilirler.

Doku kesitlerine ek olarak, LCM canlı hücreler / organizmalar, hücre yaymaları, kromozom preparatları ve bitki dokusu üzerinde gerçekleştirilebilir.

Uygulamalar

Lazer yakalama mikrodiseksiyon işlemi, toplanan numunenin veya çevreleyen hücrelerin morfolojisini ve kimyasını değiştirmez veya zarar vermez. Bu nedenle LCM, DNA , RNA ve / veya protein analizleri için seçilmiş hücreleri toplamak için yararlı bir yöntemdir . LCM, amiloid plaklar gibi aselüler yapıları izole etmek için de kullanılmıştır . LCM, kan yaymaları , sitolojik preparatlar, hücre kültürleri ve katı doku alikotları dahil olmak üzere çeşitli doku numuneleri üzerinde gerçekleştirilebilir . Dondurulmuş ve parafine gömülmüş arşiv dokusu da kullanılabilir.

Referanslar

Dış bağlantılar