Nakavt fare - Knockout mouse

Bir knockout fare ya da devre dışı bırakılmış fare , a, genetik olarak modifiye edilmiş bir fare ( Mus musculus araştırmacılar inaktive veya "sahip olduğu) bir nakavt , mevcut bir" gen değiştirerek ya da yapay bir parça ile bozarak DNA . Bunlar, dizilimi yapılmış ancak işlevleri belirlenmemiş genlerin rolünü incelemek için önemli hayvan modelleridir . Araştırmacılar, farede belirli bir genin inaktif olmasına neden olarak ve normal davranış veya fizyolojiden herhangi bir farklılık gözlemleyerek, onun olası işlevi hakkında çıkarımlarda bulunabilirler.

Fareler, şu anda, nakavt tekniğinin kolayca uygulanabileceği insanlarla en yakın akraba olan laboratuvar hayvanı türleridir . Nakavt deneylerinde, özellikle insan fizyolojisi ile ilgili genetik soruları araştıranlarda yaygın olarak kullanılırlar . Gen nakavt içinde sıçanlarda zor çok ve sadece 2003 yılından bu yana mümkün olmuştur.

Kaydedilen ilk nakavt fare, Mario R. Capecchi , Martin Evans ve Oliver Smithies tarafından 1989'da yaratıldı ve bu nedenle 2007 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü'ne layık görüldüler . Nakavt fareler üretme teknolojisinin yönleri ve farelerin kendileri birçok ülkede özel şirketler tarafından patentlenmiştir .

Kullanmak

Normal bir laboratuvar faresinin yanında, saç büyümesini etkileyen bir genin devre dışı bırakıldığı (solda) bir laboratuvar faresi gösterilmektedir.

Bir genin aktivitesini devre dışı bırakmak, o genin normalde ne yaptığı hakkında bilgi sağlar. İnsanlar farelerle birçok geni paylaşır. Sonuç olarak, nakavt farelerin özelliklerini gözlemlemek, araştırmacılara, benzer bir genin insanlarda hastalığa nasıl neden olabileceğini veya hastalığa katkıda bulunabileceğini daha iyi anlamak için kullanılabilecek bilgiler verir.

Nakavt farelerin faydalı olduğu araştırma örnekleri arasında farklı kanser türleri , obezite , kalp hastalığı , diyabet , artrit , madde kötüye kullanımı , anksiyete , yaşlanma ve Parkinson hastalığının incelenmesi ve modellenmesi yer alır . Nakavt fareler ayrıca ilaçların ve diğer tedavilerin geliştirilip test edilebileceği biyolojik ve bilimsel bir bağlam sunar.

Her yıl deneylerde milyonlarca nakavt fare kullanılmaktadır.

Suşlar

Normal bir fare ile karşılaştırıldığında obezite için bir model olan nakavt bir fare (solda).

Birkaç bin farklı nakavt fare türü vardır. Birçok fare modeli, etkisiz hale getirilen genin adını alır. Örneğin, p53 nakavt fare, hücre bölünmesini durdurarak ve/veya apoptozu indükleyerek normalde tümörlerin büyümesini baskılayan bir proteini kodlayan p53 geninden adını alır . p53 genini devre dışı bırakan mutasyonlarla doğan insanlar , erken yaşta kemik kanseri, meme kanseri ve kan kanseri geliştirme riskini önemli ölçüde artıran bir durum olan Li-Fraumeni sendromundan muzdariptir . Diğer fare modelleri, fiziksel özelliklerine veya davranışlarına göre adlandırılır.

prosedür

Karışık genotip blastosist yapma prosedürü.
Nakavt fareler üretmek için üreme şeması. Hem vahşi tipte hem de nakavt hücreler olan hücreleri içeren blastokistler, koruyucu bir annenin rahmine enjekte edilir . Bu, vahşi tipte olan ve blastosist donörü (gri) veya kimera (karışık) ile aynı renge boyanmış ve kısmen nakavt edilmiş yavrular üretir. Kimera fareleri, normal bir vahşi tip fare (gri) ile çaprazlanır. Bu, nakavt edilmiş gen veya gri ve vahşi tip için beyaz ve heterozigot olan yavrular üretir. Beyaz heterozigot fareler, daha sonra, nakavt edilmiş gen için homozigot olan fareler üretmek üzere çaprazlanabilir.

Nakavt fare üretme prosedüründe çeşitli varyasyonlar vardır; aşağıdaki tipik bir örnektir.

  1. Nakavt edilecek gen, bir fare gen kütüphanesinden izole edilir . Daha sonra orijinal gene ve onun en yakın komşu dizisine çok benzeyen yeni bir DNA dizisi tasarlanır, ancak bunun dışında geni çalışamaz hale getirmek için yeterince değiştirilir. Genellikle, yeni diziye ayrıca normal farelerin sahip olmadığı ve belirli bir toksik maddeye (örneğin neomisin) direnç kazandıran veya gözlemlenebilir bir değişiklik (örneğin renk veya floresan) üreten bir işaretleyici gen de verilir . Ek olarak, tam bir seçimi gerçekleştirmek için herpes tk+ gibi ikinci bir gen de yapıya dahil edilir.
  2. Embriyonik kök hücreler , bir fare blastosistinden (çok genç bir embriyo ) izole edilir ve in vitro büyütülür . Bu örnek için beyaz bir fareden kök hücre alacağız.
  3. Adım 1'deki yeni dizi, elektroporasyon ile adım 2'deki kök hücrelere verilir . Doğal homolog rekombinasyon süreciyle , elektroporasyona tabi tutulan kök hücrelerin bazıları , orijinal genin yerine nakavt edilmiş gen ile yeni diziyi kromozomlarına dahil edecektir . Başarılı bir rekombinasyon olayının şansı nispeten düşüktür, bu nedenle değiştirilmiş hücrelerin çoğunluğu yeni diziye iki ilgili kromozomdan sadece birinde sahip olacaktır - bunların heterozigot olduğu söylenir . Neomisin direnç genini ve herpes tk+ genini içeren bir vektör ile transforme edilen hücreler, homolog rekombinasyon yoluyla meydana gelen transformasyonları seçmek için neomisin ve Gansiklovir içeren bir solüsyonda büyütülür. Rastgele yerleştirme yoluyla meydana gelen herhangi bir DNA eklemesi, hem neomisin direnç geni hem de gen ürünü ölümcül bir toksin üretmek üzere Gansiklovir ile reaksiyona giren herpes tk+ geni için pozitif testler yaptığı için ölecektir. Ayrıca, genetik materyalin hiçbirini entegre etmeyen hücreler, her iki gen için negatif test eder ve bu nedenle neomisin ile zehirlenme sonucu ölür.
  4. Nakavt edilmiş geni içeren embriyonik kök hücreler, adım 1'deki işaretleyici gen kullanılarak değiştirilmemiş hücrelerden izole edilir. Örneğin, değiştirilmemiş hücreler, değiştirilmiş hücrelerin dirençli olduğu toksik bir madde kullanılarak öldürülebilir.
  5. Adım 4'teki nakavt edilmiş embriyonik kök hücreler, bir fare blastosistine yerleştirilir . Bu örnek için gri bir fareden alınan blastosistleri kullanıyoruz. Blastokistler artık iki tür kök hücre içerir: orijinal olanlar (gri fareden) ve nakavt hücreler (beyaz fareden). Bu blastokistler daha sonra geliştikleri dişi farelerin rahmine implante edilir . Bu nedenle yeni doğan fareler kimera olacaktır : vücutlarının bazı bölümleri orijinal kök hücrelerden, diğer bölümleri de nakavt edilmiş kök hücrelerden elde edilir. Kürkleri, nakavt edilmiş kök hücrelerden türetilen beyaz lekeler ve alıcı blastosistten gelen gri lekeler ile beyaz ve gri lekeler gösterecektir.
  6. Bazı yeni doğan chimera fareleri, nakavt edilmiş kök hücrelerden türetilen gonadlara sahip olacak ve bu nedenle, nakavt edilmiş geni içeren yumurta veya sperm üretecektir. Bu kimera fareleri, vahşi tipteki diğer farelerle melezlendiğinde, yavrularından bazıları, tüm hücrelerinde nakavt edilmiş genin bir kopyasına sahip olacaktır. Bu fareler herhangi bir gri fare DNA'sı tutmazlar ve kimera değildirler, ancak yine de heterozigotturlar.
  7. Bu heterozigot yavrular kendi aralarında çiftleştirildiğinde, yavrularından bazıları nakavt edilmiş geni her iki ebeveynden de miras alacaktır; orijinal değişmemiş genin işlevsel bir kopyasını taşımazlar (yani , o alel için homozigotturlar ).

Nakavt (KO) farelerin nasıl oluşturulduğuna dair ayrıntılı bir açıklama, 2007 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü'nün web sitesinde yer almaktadır .

sınırlamalar

Ulusal Sağlık Enstitüleri bu tekniğin bazı önemli sınırlamalarını tartışmaktadır.

Nakavt fare teknolojisi değerli bir araştırma aracını temsil ederken, bazı önemli sınırlamalar mevcuttur. Gen nakavtlarının yaklaşık yüzde 15'i gelişimsel olarak öldürücüdür, bu da genetiği değiştirilmiş embriyoların yetişkin farelere dönüşemeyeceği anlamına gelir. Bu sorun genellikle koşullu mutasyonların kullanılmasıyla aşılır . Yetişkin farelerin olmaması, çalışmaları embriyonik gelişimle sınırlandırıyor ve çoğu zaman bir genin insan sağlığıyla ilgili işlevini belirlemeyi daha da zorlaştırıyor . Bazı durumlarda gen, yetişkinlerde gelişmekte olan embriyolardan farklı bir işleve hizmet edebilir.

Bir geni devre dışı bırakmak aynı zamanda bir farede gözlemlenebilir bir değişiklik üretmede başarısız olabilir veya hatta aynı genin inaktive edildiği insanlarda gözlemlenenlerden farklı özellikler üretebilir. Örneğin, p53 genindeki mutasyonlar, insan kanserlerinin yarısından fazlasıyla ilişkilidir ve genellikle belirli bir doku grubunda tümörlere yol açar. Bununla birlikte, p53 geni farelerde devre dışı bırakıldığında, hayvanlar farklı bir doku dizisinde tümörler geliştirir.

Büyük ölçüde kök hücrelerin türetildiği türe bağlı olarak tüm prosedürde değişkenlik vardır. Genellikle soy 129'dan türetilen hücreler kullanılır. Bu spesifik suş, birçok deney için (örneğin davranışsal) uygun değildir, bu nedenle yavruları diğer suşlara geri çaprazlamak çok yaygındır . Bazı genomik lokusların nakavt edilmesinin çok zor olduğu kanıtlanmıştır. Sebepler, tekrarlayan dizilerin varlığı, kapsamlı DNA metilasyonu veya heterokromatin olabilir . Genetik materyalin nakavt segmentinde komşu 129 genin kafa karıştırıcı varlığı, "yan gen etkisi" olarak adlandırılmıştır. Bu sorunla başa çıkmak için yöntemler ve yönergeler önerilmiştir.

Diğer bir sınırlama, geleneksel (yani koşulsuz) nakavt farelerin, araştırılan genin yokluğunda gelişmesidir. Zaman zaman, gelişim sırasındaki aktivite kaybı, özellikle genin gelişimi kapsayan çok sayıda sürece dahil olması durumunda, yetişkin durumundaki genin rolünü maskeleyebilir. Daha sonra, ilgili genin ablasyonundan önce farenin normal olarak gelişmesine ve olgunlaşmasına izin veren koşullu/uyarılabilir mutasyon yaklaşımları gereklidir.

Diğer bir ciddi sınırlama, doğal olarak mutasyona uğrayan vahşi tip hayvanlarda meydana gelebilecek nakavt modelinde evrimsel adaptasyonların olmamasıdır. Örneğin, eritrosit özgü ortak tanımlamaya, GLUT1 ile stomatin sentezleyemediklerinden memelilerde telafi edici bir mekanizma teşkil C vitamini .

Ayrıca bakınız

Referanslar

Dış bağlantılar