intravital mikroskopi - Intravital microscopy
İntravital mikroskopi , canlı hayvanlarda ( in vivo ) biyolojik süreçlerin yüksek çözünürlükte gözlemlenmesini sağlayan ve bir dokunun tek tek hücreleri arasında ayrım yapmayı mümkün kılan bir mikroskopi şeklidir . Bir hayvan, intravital mikroskopi görüntüleme için kullanılmadan önce, bir görüntüleme penceresinin implantasyonunu içeren bir ameliyattan geçmelidir. Örneğin, araştırmacılar canlı bir farenin karaciğer hücrelerini görselleştirmek isterlerse, farenin karnına bir görüntüleme penceresi yerleştireceklerdir . Fareler, intravital mikroskopi için en yaygın hayvan seçimidir, ancak özel durumlarda diğer kemirgenlerörneğin sıçanlar daha uygun olabilir. Hayvanlar, ameliyatlar ve görüntüleme seansları boyunca her zaman uyuşturulur . İntravital mikroskopi, nöroloji , immünoloji , kök hücre çalışmaları ve diğerleri dahil olmak üzere çeşitli araştırma alanlarında kullanılmaktadır . Bu teknik, bir hastalığın ilerlemesini veya bir ilacın etkisini değerlendirmek için özellikle yararlıdır.
Temel kavram
İntravital mikroskopi, özel bir ameliyat sırasında hayvan dokusuna implante edilen bir görüntüleme penceresinden canlı bir hayvanın hücrelerinin görüntülenmesini içerir. İntravital mikroskopinin ana avantajı, karmaşık çok hücreli bir organizmanın gerçek ortamındayken canlı hücrelerin görüntülenmesine izin vermesidir . Bu nedenle, intravital mikroskopi, araştırmacıların hücrelerin davranışlarını bir hücre kültürü yerine doğal ortamlarında veya in vivo olarak incelemelerine olanak tanır . İntravital mikroskopinin bir başka avantajı, deneyin belirli bir süre boyunca bir organizmanın canlı dokusundaki değişiklikleri gözlemlemeye izin verecek şekilde kurulabilmesidir. Bu, immünoloji ve kök hücre araştırmaları dahil olmak üzere birçok araştırma alanı için yararlıdır .
Modern mikroskopların ve görüntüleme yazılımlarının yüksek kalitesi ayrıca canlı hayvanlarda hücre altı görüntülemeye izin verir ve bu da hücre biyolojisini in vivo moleküler düzeyde incelemeye izin verir . Gelişmeler floresan protein ilgi dokuda belirli bir zamanda belirli bir genin ifadesini kontrol etkinleştirin teknoloji ve genetik araçları da intravital mikroskopik gelişiminde önemli rol oynamıştır.
Uygun transgenik fareler üretme olasılığı, intravital mikroskopi çalışmaları için çok önemlidir. Örneğin, davranışını incelemek üzere mikroglial hücreleri içinde Alzheimer hastalığı araştırmacılar mikroglial hücrelerin görüntülenmesi için bir fare modeli olan başka bir transgenik fare ile Alzheimer hastalığının bir fare modeli olan transgenik fare melez gerekecektir. Hücrelerin görselleştirilebilmesi için bir floresan protein üretmesi gerekir ve bu, bir transgen eklenerek elde edilebilir .
görüntüleme
İntravital mikroskopi widefield floresan, dahil olmak üzere birçok ışık mikroskobu teknikleri kullanılarak yapılabilir konfokal , multiphoton , disk mikroskopisi ve diğerlerini iplik. Belirli bir tekniğin seçiminde ana husus, alanı görüntülemek için gereken penetrasyon derinliği ve gereken hücre-hücre etkileşim detaylarının miktarıdır .
İlgi alanı yüzeyin 50-100 µm altında yer alıyorsa veya hücreler arasındaki küçük ölçekli etkileşimleri yakalamaya ihtiyaç varsa, multifoton mikroskopisi gereklidir. Çok fotonlu mikroskopi, tek fotonlu konfokal mikroskoptan çok daha fazla penetrasyon derinliği sağlar. Multifoton mikroskopisi ayrıca kemik iliği hücreleri gibi kemik dokularının altında bulunan hücrelerin görüntülenmesini sağlar . Multifoton mikroskopisi ile görüntüleme için maksimum derinlik, dokunun ve deney ekipmanının optik özelliklerine bağlıdır. Doku ne kadar homojen olursa intravital mikroskopi için o kadar uygundur. Daha vaskülarize dokuların görüntülenmesi genellikle daha zordur çünkü kırmızı kan hücreleri mikroskop ışık demetinin emilmesine ve saçılmasına neden olur .
Farklı renkli proteinlerle farklı hücre soylarının floresan etiketlemesi, hücresel dinamikleri mikroortamları bağlamında görselleştirmeye izin verir . Görüntü çözünürlüğü yeterince yüksekse (50 – 100 μm), hücrelerin birbirine doğru uzanırken yaptıkları çıkıntılar dahil olmak üzere, hücresel etkileşimlerin 3B modellerini oluşturmak için birkaç görüntü kullanmak mümkün olabilir. 3D modeller zaman atlamalı görüntü dizileri hız ve hücresel hareketlerin yönünü değerlendirmek izin. Vasküler yapılar da 3D uzayda yeniden oluşturulabilir ve vasküler geçirgenlik değiştiğinde boyaların floresan sinyal yoğunluğu değiştiği için geçirgenliklerindeki değişiklikler belirli bir süre boyunca izlenebilir. Spontan ve geçici olayları görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü intravital mikroskopi kullanılabilir.
Her görüntüleme oturumundan daha fazla bilgi alınmasına izin verdiğinden, multifoton ve konfokal mikroskopiyi eşleştirmek yararlı olabilir. Bu, daha bilgilendirici görüntüler elde etmek için daha farklı hücre türlerinin ve yapılarının görselleştirilmesini ve belirli bir deney için ilgi çekici olan tüm farklı hücre türleri ve yapılarının görüntülerini elde etmek için tek bir hayvanın kullanılmasını içerir. Bu sonuncusu, Üç Rs ilkesi uygulamasının bir örneğidir .
Hücre altı yapıları görüntüleme
Geçmişte, intravital mikroskopi yalnızca biyolojik süreçleri doku veya tek hücre seviyelerinde görüntülemek için kullanılabiliyordu. Bununla birlikte, hücre altı etiketleme tekniklerinin geliştirilmesi ve hareket artefaktlarının ( bir hayvanın görüntüleme seansı sırasında kalp atışı, nefes ve peristaltik hareketlerinden kaynaklanan hatalar) en aza indirilmesindeki gelişmeler nedeniyle , bazı dokulardaki hücre içi organellerin dinamiklerini görüntülemek artık mümkün hale geliyor .
İntravital mikroskopinin sınırlamaları
İntravital mikroskopinin ana avantajlarından biri, hücrelerin mikro çevreleriyle nasıl etkileşime girdiğini gözlemleme fırsatıdır . Bununla birlikte, mikro ortamın tüm hücre tiplerinin görselleştirilmesi, mevcut ayırt edilebilir floresan etiketlerin sayısı ile sınırlıdır . Beyin gibi bazı dokuların iskelet kası gibi diğer dokulara göre daha kolay görüntülenebildiği de yaygın olarak kabul edilmektedir . Bu farklılıklar, farklı dokuların homojenliği ve şeffaflığındaki değişkenlik nedeniyle oluşur. Ek olarak, uygun hücre tiplerinde ilgili bir fenotip ve floresan proteinlere sahip transgenik fareler üretmek genellikle zorlayıcı ve zaman alıcıdır. Transgenik farelerin kullanımı ile ilgili bir başka problem, vahşi tipte bir fare ile ilgilenilen fenotipi temsil eden bir transgenik fare arasında gözlemlenen değişiklikleri yorumlamanın bazen zor olmasıdır . Bunun nedeni , benzer işleve sahip genlerin , genellikle bir dereceye kadar adaptasyona yol açan değiştirilmiş geni telafi edebilmesidir.
Referanslar
Dış bağlantılar
-
İlgili Medya Intravital mikroskopi Wikimedia Commons
