Yeşil floresan proteini - Green fluorescent protein
| Yeşil floresan proteini | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Yapısı Aequorea victoria yeşil flüoresan protein.
| |||||||||
| tanımlayıcılar | |||||||||
| Sembol | GFP | ||||||||
| Pfam | PF01353 | ||||||||
| Pfam klanı | CL0069 | ||||||||
| InterPro | IPR011584 | ||||||||
| CATH | 1ema | ||||||||
| SCOP2 | 1ema / KAPSAM / SUPFAM | ||||||||
| |||||||||
| Yeşil floresan proteini | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| tanımlayıcılar | |||||||
| organizma | |||||||
| Sembol | GFP | ||||||
| UniProt | P42212 | ||||||
| |||||||
Yeşil floresan proteini ( GFP ) a, protein sergileyen parlak yeşil olduğu floresan için mavi ışık maruz ultraviyole aralığı. GFP etiketi geleneksel olarak ilk olarak denizanası Aequorea victoria'dan izole edilen proteini ifade eder ve bazen avGFP olarak adlandırılır . Ancak, GFPs dahil diğer organizmalar bulunmuştur mercan , anemonları , zoanithids , kopepodlar ve lancelets .
GFP A. victoria büyük olan uyarım tepe bir de dalga boyu 395 nm ve 475 nm'de küçük bir on. Emisyon zirvesi, görünür spektrumun alt yeşil kısmında bulunan 509 nm'dedir . GFP'nin floresan kuantum verimi (QY) 0.79'dur. Deniz hercai menekşesinden ( Renilla reniformis ) elde edilen GFP , 498 nm'de tek bir ana uyarma zirvesine sahiptir. GFP, moleküler oksijen dışında herhangi bir yardımcı kofaktör , gen ürünü veya enzim / substrat gerektirmeden dahili bir kromofor oluşturma yeteneği nedeniyle biyolojinin birçok biçiminde mükemmel bir araçtır .
Olarak hücre ve moleküler biyoloji , GFP geni sık olarak kullanılan ekspresyon raportör . Biyosensörler yapmak için değiştirilmiş formlarda kullanılmıştır ve bir genin belirli bir organizma boyunca, seçilen organlarda veya ilgili hücrelerde ifade edilebileceği kavramının bir kanıtını gösteren GFP'yi ifade eden birçok hayvan yaratılmıştır . GFP, transgenik teknikler yoluyla hayvanlara veya diğer türlere dahil edilebilir ve onların ve yavrularının genomlarında muhafaza edilebilir. Bugüne kadar GFP, insan hücreleri de dahil olmak üzere bakteri, maya, mantar, balık ve memeliler dahil olmak üzere birçok türde ifade edilmiştir. Bilim adamları Roger Y. Tsien , Osamu Shimomura ve Martin Chalfie , yeşil floresan proteini keşfetmeleri ve geliştirmeleri nedeniyle 10 Ekim 2008'de 2008 Nobel Kimya Ödülü'ne layık görüldüler .
GFP ve benzer floresan proteinler için ticari olarak temin edilebilen genlerin çoğu, yaklaşık 730 baz çifti uzunluğundadır. Doğal protein 238 amino aside sahiptir. Moleküler kütlesi 27 kD'dir. Bu nedenle, GFP geninin ilgili bir proteinin geniyle kaynaştırılması, proteinin boyutunu ve moleküler kütlesini önemli ölçüde artırabilir ve proteinin doğal işlevini bozabilir veya hücre içindeki yerini veya taşıma yörüngesini değiştirebilir.
Arka plan
Vahşi tip GFP (wtGFP)
1960'larda ve 1970'lerde, GFP, ayrı lüminesan protein aequorin ( lusiferinin parçalanmasını katalize eden, ışığı serbest bırakan bir enzim ) ile birlikte ilk olarak denizanası Aequorea victoria'dan ve Osamu Shimomura tarafından incelenen özelliklerinden saflaştırıldı . Gelen A. victoria zaman, GFP floresan meydana Aequorin ile etkileşime girer , Ca + 2 , mavi bir ışıltı indükleyici iyonları. Bu ışıldayan enerjinin bir kısmı, genel rengi yeşile kaydırarak GFP'ye aktarılır. Ancak moleküler biyologlar için bir araç olarak faydası 1992 yılına kadar gerçekleştirilecektir başlar yoktu Douglas Prasher içinde wtGFP klonlanmasını ve nükleotid sekansı rapor Gene . Bu projenin finansmanı tükendi, bu yüzden Prasher birkaç laboratuvara cDNA örnekleri gönderdi . Martin Chalfie'nin laboratuvarı , ilk birkaç amino asit silinmiş olarak, E. coli ve C. elegans'ın heterolog hücrelerinde wtGFP'nin kodlama dizisini ifade etti ve sonuçları Science'da 1994'te yayınladı . Frederick Tsuji'nin laboratuvarı bağımsız olarak rekombinantın ekspresyonunu bildirdi. bir ay sonra protein Dikkat çekici bir şekilde, GFP molekülü, denizanasına özgü eksojen kofaktörlere ihtiyaç duymadan katlanmış ve oda sıcaklığında floresan olmuştur. Bu ağırlıkça yakın GFP floresan olmasına rağmen, çift tepeli uyarma spektrumu, pH duyarlılığı, klorür duyarlılığı, zayıf floresan kuantum verimi, zayıf fotostabilite ve 37 °C'de zayıf katlanma dahil olmak üzere birçok dezavantajı vardı.
Bir GFP'nin ilk rapor edilen kristal yapısı, 1996'da Science'da Remington grubu tarafından S65T mutantınınkiydi . Bir ay sonra, Phillips grubu Nature Biotechnology'de bağımsız olarak vahşi tip GFP yapısını bildirdi . Bu kristal yapılar, kromofor oluşumu ve komşu kalıntı etkileşimleri üzerinde hayati bir arka plan sağladı . Araştırmacılar, günümüzde kullanılan çok çeşitli GFP türevlerini üretmek için yönlendirilmiş ve rastgele mutajenez yoluyla bu kalıntıları modifiye ettiler. GFP ile ilgili daha fazla araştırma, deterjanlara, proteazlara, guanidinyum klorür (GdmCl) işlemlerine ve şiddetli sıcaklık değişikliklerine karşı dirençli olduğunu göstermiştir.
GFP türevleri
Yaygın kullanım potansiyeli ve araştırmacıların gelişen ihtiyaçları nedeniyle, GFP'nin birçok farklı mutantı tasarlanmıştır. İlk büyük gelişme, 1995 yılında Roger Tsien tarafından Nature'da bildirilen tek nokta mutasyonu (S65T) idi . Bu mutasyon, GFP'nin spektral özelliklerini önemli ölçüde iyileştirdi, artan floresan, fotostabilite ve ana uyarma zirvesinin 488 nm'ye kayması ile sonuçlandı, zirve emisyonu 509 nm'de tutuldu. Bu, yaygın olarak bulunan FITC filtre setlerinin spektral özellikleriyle eşleşti ve genel araştırmacı tarafından kullanım pratikliğini artırdı. Geliştirilmiş GFP ( EGFP ) sağlayan bu iskele için bir 37 °C katlama verimliliği (F64L) noktası mutantı , 1995 yılında Thastrup ve Falkow laboratuvarları tarafından keşfedildi. EGFP, memeli hücrelerinde GFP'lerin pratik kullanımına izin verdi. EGFP bir sahiptir sönüm katsayısı 55,000 M (gösterilen ε) -1 cm -1 . EGFP'nin floresan kuantum verimi (QY) 0.60'tır. ε•QY olarak ifade edilen bağıl parlaklık 33.000 M -1 cm -1'dir .
Superfolder GFP ( sfGFP ), GFP'nin zayıf katlanan peptitlerle kaynaştığında bile hızla katlanmasına ve olgunlaşmasına izin veren bir dizi mutasyon, 2006'da rapor edildi.
Renk mutantları dahil olmak üzere birçok başka mutasyon yapılmıştır; özellikle mavi floresan proteini (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), camgöbeği floresan proteini (ECFP, Cerulean, CyPet, mTurquoise2) ve sarı floresan protein türevleri (YFP, Citrine, Venus, YPet). BFP türevleri (mKalama1 hariç) Y66H ikamesini içerir. 380 nanometreye yakın morötesinde geniş bir absorpsiyon bandı ve 448 nanometrede maksimum emisyon sergilerler. Tercihen Zn(II) ve Cu(II) 'yi bağlayan yeşil bir floresan protein mutantı ( BFPms1 ) geliştirilmiştir. BFPms1, BFP kromoforu (Y66H), daha yüksek kuantum verimi için Y145F, beta varilinde bir delik oluşturmak için H148G ve çözünürlüğü artıran diğer birkaç mutasyon dahil olmak üzere birçok önemli mutasyona sahiptir. Zn(II) bağlanması floresan yoğunluğunu arttırırken Cu(II) bağlanması floresansı söndürür ve maksimum absorbansı 379'dan 444 nm'ye kaydırır. Bu nedenle Zn biyosensörü olarak kullanılabilirler.
Kromofor bağlama . Camgöbeği türevlerindeki kritik mutasyon, kromoforun fenol bileşeni yerine bir indol ile oluşmasına neden olan Y66W ikamesidir . İndol grubunun artan kütlesinden dolayı bu değiştirilmiş kromoforun parlaklığını geri kazanmak için çevreleyen namluda birkaç ek telafi edici mutasyon gereklidir. ECFP ve Cerulean'da, yedinci ipliğin N-terminali yarısı iki konformasyon sergiler. Bu konformasyonların her ikisi de kromofor ile karmaşık bir van der Waals etkileşimleri kümesine sahiptir. Cerulean'daki Y145A ve H148D mutasyonları bu etkileşimleri stabilize eder ve kromoforun daha düzlemsel, daha iyi paketlenmiş ve çarpışmalı söndürmeye daha az eğilimli olmasını sağlar.
Floresan ömrüne dayalı tarama ile kombinasyon halinde ek sahaya yönelik rastgele mutajenez , yedinci β-şeritini daha da stabilize etti ve 0.93'lük bir kuantum verimi (QY) ile parlak bir varyant olan mTurquoise2 ile sonuçlandı. YFP türevlerinin kırmızıya kaydırılmış dalga boyu, T203Y mutasyonu ile gerçekleştirilir ve ikame edilmiş tirozin tortusu ile kromofor arasındaki π-elektron istifleme etkileşimlerinden kaynaklanır. Bu iki spektral değişken sınıfı genellikle Förster rezonans enerji transferi ( FRET ) deneyleri için kullanılır. Kalsiyum veya glutamat, protein fosforilasyon durumu, protein tamamlama, reseptör dimerizasyonu ve diğer işlemler gibi hücre sinyal moleküllerine duyarlı genetik olarak kodlanmış FRET raportörleri, gerçek zamanlı olarak hücre aktivitesinin oldukça spesifik optik okumalarını sağlar.
Bir dizi tortunun yarı rasyonel mutagenezi, pHluorinler olarak bilinen pH'a duyarlı mutantlara ve daha sonra süper-ekliptik pHluorinlere yol açtı. Sinaptik vezikül füzyonu üzerine pH'daki hızlı değişiklikten yararlanarak, nöronlardaki sinaptik aktiviteyi görselleştirmek için sinaptobrevin'e etiketlenen pHluorinler kullanılmıştır.
Redoks duyarlı GFP ( roGFP ), sisteinlerin beta varil yapısına eklenmesiyle tasarlandı. Redoks sistein durumu belirleyen floresan özelliklerini roGFP .
isimlendirme
Değiştirilmiş GFP'lerin adlandırılması, birkaç GFP sürümünün tek bir ad üzerinde çakışan eşlemesi nedeniyle genellikle kafa karıştırıcıdır. Örneğin, mGFP genellikle , GFP'nin hücre zarlarına bağlanmasına neden olan bir N-terminal palmitoilasyonuna sahip bir GFP'ye atıfta bulunur . Bununla birlikte, aynı terim, genellikle A206K mutasyonunu kıran dimer arayüzü ile elde edilen monomerik GFP'ye atıfta bulunmak için de kullanılır . Yabani tip GFP, 5 mg/mL'nin üzerindeki konsantrasyonlarda zayıf bir dimerizasyon eğilimine sahiptir . mGFP ayrıca bitki hücrelerinde stabil ekspresyon için amino asit değişimi yoluyla optimize edilmiş "modifiye GFP" anlamına gelir.
Doğada
Denizanasında hem (birincil) biyolüminesansın ( aequorin'in luciferin üzerindeki etkisinden) hem de GFP'nin (ikincil) floresansının amacı bilinmemektedir. GFP, denizanası çanının kenarındaki küçük granüllerde aequorin ile birlikte ifade edilir. GFP'nin ikincil uyarma zirvesi (480 nm), aequorin'in mavi emisyonunun bir kısmını emerek biyolüminesansa daha yeşil bir renk verir. GFP kromoforunun serin 65 kalıntısı , vahşi tip GFP'nin çift tepeli uyarma spektrumundan sorumludur. Orijinal olarak Prasher tarafından klonlanan üç GFP izoformunun hepsinde korunur. Bu tortunun neredeyse tüm mutasyonları, uyarma spektrumlarını 395 nm veya 480 nm'de tek bir tepe noktasına konsolide eder. Bu duyarlılığın kesin mekanizması karmaşıktır, ancak öyle görünüyor ki, serin 65'ten glutamat 222'ye, kromofor iyonizasyonunu etkileyen bir hidrojen bağışını içerir. Tek bir mutasyon, 480 nm uyarma zirvesini çarpıcı biçimde artırabildiğinden, GFP'yi aequorin'in çok daha verimli bir ortağı haline getirdiğinden, A. victoria evrimsel olarak daha az verimli, çift tepeli uyarma spektrumunu tercih ediyor gibi görünmektedir. Roger Tsien, derinlikle değişen hidrostatik basıncın, serin 65'in kromofora bir hidrojen bağışlama ve iki uyarma tepe noktasının oranını değiştirme yeteneğini etkileyebileceğini tahmin etmiştir. Böylece denizanası, biyolüminesansının rengini derinlikle değiştirebilir. Ancak, GFP'nin ilk keşfedildiği Friday Harbor'daki denizanası popülasyonundaki bir çöküş , GFP'nin denizanasının doğal ortamındaki rolünün daha fazla araştırılmasını engellemiştir.
Çoğu neşter türünün vücutlarının çeşitli bölgelerinde GFP ürettiği bilinmektedir. A. victoria'nın aksine , neşterler kendi mavi ışıklarını üretmezler ve endojen GFP'lerinin kaynağı hala bilinmemektedir. Bazıları, planktonları neşterin ağzına doğru çektiğini ve pasif bir avlanma mekanizması olarak hizmet ettiğini düşünüyor . Ayrıca larvalarda fotokoruyucu bir ajan olarak da hizmet edebilir , yüksek yoğunluklu mavi ışığın neden olduğu hasarı düşük yoğunluklu yeşil ışığa dönüştürerek önleyebilir. Ancak, bu teoriler test edilmemiştir.
GFP-benzeri proteinler , özellikle Pontellidae ve Aetideidae familyalarından çok sayıda deniz kopepod türünde bulunmuştur . Pontella mimocerami'den izole edilen GFP, 0.92'lik bir kuantum verimi ile yüksek seviyelerde parlaklık göstermiştir , bu da onları A. victoria'dan izole edilen yaygın olarak kullanılan EGFP'den neredeyse iki kat daha parlak hale getirir .
Diğer floresan proteinler
GFP ile aynı protein ailesinde olmasına rağmen, doğrudan Aequorea victoria'dan türetilmeyen birçok GFP benzeri protein vardır . Bunlara dsRed , eqFP611, Dronpa, TagRFP'ler, KFP, EosFP/IrisFP, Dendra vb. dahildir. Farklı organizmalardaki proteinlerden geliştirilmiş olan bu proteinler, bazen kromofor oluşumuna beklenmedik yaklaşımlar gösterebilir. Bunlardan bazıları, örneğin KFP, mutajenez yoluyla büyük ölçüde iyileştirilecek doğal olarak flüoresan olmayan veya zayıf flüoresan proteinlerden geliştirilir. Farklı spektrum özelliklerine sahip GFP benzeri variller kullanıldığında, bir kromoforun uyarma spektrumu, başka bir kromoforu (FRET) güçlendirmek için kullanılabilir ve bu da ışığın dalga boyları arasında dönüşüme izin verir.
FMN bağlayıcı floresan proteinler (FbFP'ler) 2007'de geliştirildi ve mavi ışık reseptörlerinden türetilen küçük (11-16 kDa), oksijenden bağımsız floresan proteinlerin bir sınıfıdır. Flavin kromoforunun oluşumu ve bağlanması, GFP kromoforunun sentezinde olduğu gibi moleküler oksijen gerektirmediğinden, özellikle anaerobik veya hipoksik koşullar altında kullanım için tasarlanmıştır.
Bilirubinli UnaG gibi diğer kromoforlara sahip floresan proteinler, 600 nm'nin üzerinde kırmızıya kaydırılmış emisyon veya yeşil yayan durumdan kırmızı yayan duruma fotodönüşüm gibi benzersiz özellikler gösterebilir. Kırmızı ve yeşil ışık arasında dönüşüm elde etmek için yeterince ayrı uyarma ve emisyon dalga boylarına sahip olabilirler.
Yeni bir sınıf floresan protein bir gelişti edildi siyanobakteriyel ( Trichodesmium erythraeum ) fikobilıprotein , α- alofikokiyanin ve adlandırılmış küçük ultra kırmızı floresan proteini ( smURFP 2016 yılında) smURFP otokatalitik kendini birleştirir kromofor biliverdin harici gerek kalmadan protein , liyaz olarak bilinir . Denizanası ve mercan türevi GFP benzeri proteinler oksijen gerektirir ve kromofor oluşumu üzerine stokiyometrik miktarda hidrojen peroksit üretir . smURFP oksijen gerektirmez veya hidrojen peroksit üretmez ve kromofor , biliverdin kullanır . smURFP büyük bir yok olma katsayısına (180.000 M -1 cm -1 ) ve mütevazı bir kuantum verimine (0.20) sahiptir, bu da onu eGFP ile karşılaştırılabilir biyofiziksel parlaklık ve türetilen çoğu kırmızı veya uzak kırmızı floresan proteinden ~ 2 kat daha parlak yapar . mercan . smURFP spektrum özellikleri organik boyanın benzer Cy5 .
Yeni flüoresan protein sınıfları ve uygulamaları hakkındaki incelemeler, belirtilen incelemelerde bulunabilir.
Yapı
GFP, merkezden geçen kovalent olarak bağlı kromofor 4-( p- hidroksibenziliden)imidazolidin-5-on (HBI) içeren bir alfa sarmalına sahip, kıvrımlı bir tabaka düzenlemesine sahip on bir β-şeritinden oluşan bir beta fıçı yapısına sahiptir . Beş daha kısa alfa sarmalı, yapının uçlarında başlıklar oluşturur. Beta namlu yapısı neredeyse mükemmel bir silindir, 42a, uzun ve 24a çapı (bazı çalışmalar 30A bir çapa bildirmiştir) olup, GFP gibi ailesine özgü olan bir "β-can" oluşumu olarak adlandırılan oluşturma . Ser65–Tyr66–Gly67 tripeptitinin kendiliğinden modifiye edilmiş formu olan HBI, uygun şekilde katlanmış GFP iskelesinin yokluğunda floresan değildir ve esas olarak wtGFP'de iyonize edilmemiş fenol formunda bulunur. Namlunun içe bakan yan zincirleri, Ser65–Tyr66–Gly67'de HBI'nın fenolat formuna iyonizasyonunu ve kromofor oluşumunu indükleyen spesifik siklizasyon reaksiyonlarını indükler . Bu çeviri sonrası değişiklik sürecine olgunlaşma denir . Bu yan zincirlerle hidrojen bağlama ağı ve elektron istifleme etkileşimleri, GFP'nin ve sayısız türevlerinin rengini, yoğunluğunu ve fotostabilitesini etkiler. Namlunun sıkıca paketlenmiş yapısı solvent moleküllerini dışarıda bırakarak kromofor floresansının su ile söndürülmesini engeller. Ser65-Tyr66-Gly67'nin oto-siklizasyonuna ek olarak, Tyr66 tortusunda bir 1,2-dehidrojenasyon reaksiyonu meydana gelir. Kromoforu oluşturan üç kalıntının yanı sıra, Gln94, Arg96, His148, Thr203 ve Glu222 gibi kalıntıların tümü stabilizatör görevi görür. Gln94, Arg96 ve His148 kalıntıları, kromofor yükünün yerini değiştirerek stabilize edebilmektedir. Arg96, HBI halkasından gerekli olan gerekli yapısal yeniden düzenlemeleri harekete geçirmesi nedeniyle en önemli stabilize edici kalıntıdır. Arg96 kalıntısındaki herhangi bir mutasyon, uygun elektrostatik ve sterik etkileşimler kaybolacağından, kromoforun gelişme hızında bir azalmaya neden olacaktır. Tyr66, hidrojen bağlarının alıcısıdır ve uygun elektrostatikler üretmek için iyonlaşmaz.
Çizgi film tarzında çizilmiş GFP molekülleri, biri tamamen, diğeri ise kromoforu ortaya çıkarmak için beta namlusunun kenarı kesilmiş ( top ve çubuk olarak vurgulanmıştır ). Gönderen PDB : 1GFL .
|
Uygulamalar
Muhabir tahlilleri
Yeşil floresan proteini bir haberci gen olarak kullanılabilir .
Örneğin, GFP, çevresel toksisite seviyeleri için bir raportör olarak kullanılabilir. Bu proteinin etanol, p- formaldehit, fenol, triklosan ve paraben dahil olmak üzere çeşitli kimyasalların toksisite seviyelerini ölçmenin etkili bir yolu olduğu gösterilmiştir . GFP, bir haberci protein olarak harikadır çünkü konakçının hücresel ortamına tanıtıldığında konak üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Bu yetenek nedeniyle, harici görselleştirme lekesi, ATP veya kofaktörlere gerek yoktur. Kirletici seviyeleri ile ilgili olarak, kirleticilerin konakçı hücre üzerindeki etkisini ölçmek için floresans ölçülmüştür. Konak hücrenin hücresel yoğunluğu da ölçüldü. Song, Kim ve Seo (2016) tarafından yürütülen çalışmanın sonuçları, kirletici seviyeleri arttıkça hem floresanda hem de hücresel yoğunlukta bir azalma olduğunu göstermiştir. Bu, hücresel aktivitenin azaldığı gerçeğinin bir göstergesiydi. GFP'nin kirletici bir işaretleyici olarak hareket ettiği mekanizmayı belirlemek için bu özel uygulamaya yönelik daha fazla araştırma. Zebra balıklarında da benzer sonuçlar gözlemlenmiştir, çünkü GFP enjekte edilen zebra balıkları, GFP enjekte edilmeyen zebra balıklarına göre hücresel stresleri tanımaya yaklaşık yirmi kat daha duyarlıdır.
Avantajlar
GFP'nin en büyük avantajı, nasıl ortaya çıktığına bağlı olarak kalıtsal olabilmesi ve ifade edildiği hücre ve dokuların sürekli çalışmasına izin vermesidir. GFP'nin görselleştirilmesi invaziv değildir ve yalnızca mavi ışıkla aydınlatma gerektirir. GFP tek başına biyolojik süreçlere müdahale etmez, ancak ilgili proteinlerle kaynaştığında, ilgilenilen proteinin işlevini sürdürmek için bağlayıcıların dikkatli tasarımı gerekir. Ayrıca, bir monomer ile birlikte kullanıldığında, hücreler boyunca kolayca yayılabilir.
Floresan mikroskobu
GFP ve türevlerinin mevcudiyeti, floresan mikroskopisini ve hücre biyolojisi ve diğer biyolojik disiplinlerde kullanılma şeklini baştan sona yeniden tanımlamıştır . FITC (flüoresan izotiyosiyanat) gibi çoğu küçük flüoresan molekülü canlı hücrelerde kullanıldığında güçlü bir şekilde fototoksik iken, GFP gibi flüoresan proteinler canlı hücrelerde aydınlatıldığında genellikle çok daha az zararlıdır. Bu, flüoresan proteinlerle etiketlenmiş bir veya daha fazla proteini eksprese eden hücreleri zaman içinde gözlemlemek için kullanılabilen yüksek oranda otomatikleştirilmiş canlı hücre floresan mikroskopi sistemlerinin gelişimini tetiklemiştir.
GFP'yi canlı hücre görüntüleme deneyinde kullanmak için birçok teknik vardır. GFP'yi kullanmanın en doğrudan yolu, onu doğrudan ilgilenilen bir proteine bağlamaktır. Örneğin, GFP, ilgili bir genin başarılı bir transfeksiyonunu belirtmek için diğer genleri eksprese eden bir plazmide dahil edilebilir. Başka bir yöntem, flüoresan zamanlayıcı olarak adlandırılan, flüoresansın zamanla yeşilden sarıya değişeceği bir mutasyon içeren bir GFP kullanmaktır. Floresan zamanlayıcı ile araştırmacılar, floresan protein tarafından bildirilen renge dayalı olarak yakın zamanda etkinleştirilen, sürekli etkinleştirilen veya yakın zamanda devre dışı bırakılan gibi protein üretiminin durumunu inceleyebilir. Yine başka bir örnekte, bilim adamı GFP'yi ancak radyasyona maruz kaldıktan sonra aktif hale gelecek şekilde değiştirdi ve araştırmacılara bir hücrenin belirli kısımlarını seçici olarak aktive etmek ve GFP ile etiketlenen proteinlerin başlangıç konumundan nereye hareket ettiğini gözlemlemek için bir araç verdi. Bunlar, gelişen floresan mikroskopi alanındaki sadece iki örnektir ve GFP ve diğer floresan proteinleri kullanan biyosensörlerin daha eksiksiz bir incelemesini burada bulabilirsiniz.
Örneğin, GFP ifadesinin belirli bir özellik için bir işaret olarak kullanılabileceği Drosophila melanogaster'de olduğu gibi, tanımlama amacıyla çeşitli organizmaların spermlerinin etiketlenmesinde GFP yaygın olarak kullanılmıştır . GFP, morfolojik ayrım sağlayan farklı yapılarda da ifade edilebilir. Bu gibi durumlarda, GFP üretimi için gen, hedef proteinleri kodlayan ve aynı düzenleyici dizi tarafından kontrol edilen DNA bölgesindeki organizmanın genomuna dahil edilir ; yani, genin düzenleyici dizisi artık etiketli protein(ler)e ek olarak GFP üretimini kontrol etmektedir. Genin ifade edildiği ve etiketli proteinlerin üretildiği hücrelerde, aynı zamanda GFP üretilir. Bu nedenle, yalnızca etiketli genin ifade edildiği veya hedef proteinlerin üretildiği hücreler, floresan mikroskobu altında gözlemlendiğinde floresan verecektir. Bu tür hızlandırılmış filmlerin analizi, geçmişte sabit (yani ölü) malzeme kullanılarak çalışılmış olan protein katlanması, protein taşınması ve RNA dinamikleri dahil olmak üzere birçok biyolojik sürecin anlaşılmasını yeniden tanımladı. Elde edilen veriler, hücre içi sistemlerin matematiksel modellerini kalibre etmek ve gen ekspresyon oranlarını tahmin etmek için de kullanılır. Benzer şekilde GFP, heterolog sistemlerde protein ekspresyonunun bir göstergesi olarak kullanılabilir. Bu senaryoda, GFP içeren füzyon proteinleri, yapının RNA'sı kullanılarak dolaylı olarak veya etiketli proteinin kendisiyle doğrudan dahil edilir. Bu yöntem, floresan mikroskobu ile makromoleküler veya tek molekül ölçeğinde etiketli proteinin yapısal ve fonksiyonel özelliklerini incelemek için kullanışlıdır.
Vertico SMI SPDM Phymod teknolojisi kullanılarak mikroskop 10 nm'lik bir optik çözünürlük tek moleküller olarak lokalize GFP ve bunun türevleri gibi fluoresan boyaların sözde "tersine çevrilebilir ışıkla ağartma" etkisini kullanır. Bu aynı zamanda iki GFP türevinin (2CLM) ortak lokalizasyonu olarak da gerçekleştirilebilir.
GFP'nin bir başka güçlü kullanımı, proteini küçük spesifik hücre kümelerinde ifade etmektir. Bu, araştırmacıların belirli hücre tiplerini in vitro (bir tabakta) veya hatta in vivo (canlı organizmada) optik olarak tespit etmelerini sağlar . GFP'nin birkaç spektral varyantını genetik olarak birleştirmek, beyin devrelerinin analizi için yararlı bir numaradır ( Brainbow ). Floresan proteinlerin literatürdeki diğer ilginç kullanımları arasında, nöron membran potansiyeli sensörleri olarak FP'lerin kullanılması , hücre zarlarında AMPA reseptörlerinin izlenmesi , viral giriş ve bireysel influenza virüslerinin ve lentiviral virüslerin enfeksiyonu vb. yer alır.
Ayrıca, transgenik GFP sıçanlarının yeni hatlarının, rejeneratif tıp kadar gen tedavisi için de uygun olabileceği bulunmuştur. "Yüksek ifadeli" GFP kullanarak, transgenik sıçanlar çoğu dokuda ve önceki GFP-transgenik sıçanlarda karakterize edilmemiş veya sadece zayıf şekilde karakterize edilmiş birçok hücrede yüksek ekspresyon sergiler.
GFP'nin bir canlılık tahlili olarak kriyobiyolojide faydalı olduğu gösterilmiştir . Tripan mavisi tahlilleriyle ölçüldüğü üzere canlılığın korelasyonu 0.97 idi. Başka bir uygulama, memeli hücrelerinde transfeksiyon verimliliği için dahili kontrol olarak GFP ortak transfeksiyonunun kullanılmasıdır.
GFP'nin yeni bir olası kullanımı, insan embriyonik böbrek hücre hattından yapılmış bir eGFP lazer sistemi aracılığıyla hücre içi süreçlerin hassas bir monitörü olarak kullanılmasını içerir. İlk tasarlanmış canlı lazer, yansıtıcı bir optik boşluk içinde bir eGFP ifade eden hücre tarafından yapılır ve ona mavi ışık darbeleri ile çarpar. Belirli bir darbe eşiğinde, eGFP'nin optik çıkışı, 516 nm dalga boyunda saf yeşil renkte daha parlak ve tamamen tek tip hale gelir. Lazer ışığı olarak yayılmadan önce, ışık rezonatör boşluğu içinde ileri geri sıçrar ve hücreyi defalarca geçer. Araştırmacılar, optik aktivitedeki değişiklikleri inceleyerek hücresel süreçleri daha iyi anlayabilirler.
GFP, kanser hücrelerini etiketlemek ve izlemek için kanser araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. GFP etiketli kanser hücreleri, kanser hücrelerinin uzak organlara yayılma süreci olan metastazı modellemek için kullanılmıştır.
Bölünmüş GFP
GFP, proteinlerin kollokalizasyonunu analiz etmek için kullanılabilir. Bu, proteini kendi kendine birleşebilen iki parçaya "bölerek" ve ardından bunların her birini ilgili iki proteinle kaynaştırarak elde edilir. Tek başına, bu eksik GFP fragmanları floresan yapamaz. Bununla birlikte, ilgilenilen iki protein birlikte yerleşirse, o zaman iki GFP fragmanı, floresan yayabilen GFP benzeri bir yapı oluşturmak üzere bir araya toplanır. Bu nedenle, flüoresans seviyesini ölçerek, ilgilenilen iki proteinin birlikte yerleşip yerleşmediğini belirlemek mümkündür.
Makro fotoğrafçılık
Virüs enfeksiyonlarının yayılması gibi makro ölçekli biyolojik süreçler GFP etiketlemesi kullanılarak takip edilebilir. Geçmişte, mutajenik ultraviyole ışık (UV), canlı organizmaları aydınlatmak için (örn. bkz.) GFP ifadesini tespit etmek ve fotoğraflamak için kullanılmıştır. Son zamanlarda, makro fotoğrafçılık için mutajenik olmayan LED ışıkları kullanan bir teknik geliştirilmiştir. Teknik, epifloresan mikroskopların yapımında kullanılanla aynı prensibe dayalı bir epifloresan kamera eklentisi kullanır .
Transgenik evcil hayvanlar
Yeşil flüoresan bir tavşan olan Alba , sanat ve sosyal yorum amacıyla GFP kullanılarak Eduardo Kac tarafından görevlendirilen bir Fransız laboratuvarı tarafından yaratıldı . ABD'li Yorktown Technologies şirketi , başlangıçta su yollarındaki kirliliği tespit etmek için geliştirilen yeşil floresan zebra balığı ( GloFish ) akvaryum mağazalarına pazarlıyor . ABD merkezli bir şirket olan NeonPets, evcil hayvan endüstrisine NeonMice olarak yeşil floresan fareler pazarladı. Noels olarak bilinen yeşil floresan domuzlar, Ulusal Tayvan Üniversitesi Hayvan Bilimi ve Teknolojisi Bölümünde Wu Shinn-Chih liderliğindeki bir grup araştırmacı tarafından yetiştirildi . Bir Japon-Amerikan Ekibi , onları potansiyel olarak hastalıklar, özellikle HIV için model organizmalar olarak kullanmak için konsept kanıtı olarak yeşil floresan kedileri yarattı . 2009'da Seul Ulusal Üniversitesi'nden bir Güney Koreli ekip , deniz anemonlarından fibroblast hücreleri ile ilk transgenik beagle'ları yetiştirdi . Köpekler kırmızı bir floresan ışığı yayarlar ve bilim adamlarının narkolepsi ve körlük gibi insan hastalıklarına neden olan genleri incelemesine izin vermek içindir.
Sanat
"Protein heykelleri" konusunda uzmanlaşmış Alman doğumlu bir sanatçı olan Julian Voss-Andreae , 1.70 m (5'6") uzunluğundaki "Yeşil Floresan Protein" (2004) ve 1.40 m (2004) dahil olmak üzere GFP'nin yapısına dayalı heykeller yarattı. 4'7") boyunda "Çelik Denizanası" (2006). İkinci heykel GFP adlı keşif yerinde bulunan Shimomura 1962 yılında, Washington Üniversitesi 'nin Cuma Harbor Laboratories .
.jpg)
Ayrıca bakınız
Referanslar
daha fazla okuma
- Pieribone V, Gruber D (2006). Karanlıkta Aglow: Biyofloresansın Devrimci Bilimi . Cambridge: Belknap Basını. ISBN'si 978-0-674-01921-8. OCLC 60321612 . GFP'nin tarihini ve keşfini anlatan popüler bilim kitabı
- Zimmer M (2005). Parlayan Genler: Biyoteknolojide Bir Devrim . Buffalo, NY: Prometheus Kitapları. ISBN'si 978-1-59102-253-4. OCLC 56614624 .
Dış bağlantılar
|
Yeşil floresan protein hakkında kütüphane kaynakları |
- Scholarpedia'da floresan proteinler hakkında kapsamlı bir makale
- Önemli GFP belgelerinin kısa özeti
- GFP kromoforunun oluşumunun arkasındaki kimyayı gösteren etkileşimli Java uygulaması
- Roger Tsien'in floresan proteinler üzerine 2008 Nobel Ödülü dersinin videosu
- Çeşitli floresan proteinler için uyarma ve emisyon spektrumları
- 2008 Nobel Kimya Ödülü sahipleri, Profesörler Osamu Shimomura , Martin Chalfie ve Roger Y. Tsien'e adanmış Yeşil Floresan Protein Chem Soc Rev temalı sayı
- Ayın Molekülü, Haziran 2003 : David Goodsell tarafından GFP'ye resimli bir genel bakış.
- Ayın Molekülü, Haziran 2014 : David Goodsell'in GFP-benzeri varyantlara resimli bir genel bakış.
- FPbase üzerinde Yeşil Floresan Protein , bir floresan protein veritabanı
- Uygun yapısal bilginin her genel PDB için Uniprot : P42212 (yeşil floresan protein) de PDBe-KB .