DNA aşısı - DNA vaccine

DNA aşısı yapımı.

Bir DNA aşısı , bir bağışıklık tepkisini indüklemek için bir mekanizma olarak bir organizmanın hücrelerine spesifik bir antijen kodlayan DNA dizisini transfekte eden bir aşı türüdür .

DNA aşıları , bir bağışıklık tepkisinin arandığı antijeni/antijenleri kodlayan DNA dizisini içeren genetik olarak tasarlanmış plazmidi enjekte ederek çalışır , böylece hücreler doğrudan antijeni üretir ve böylece koruyucu bir immünolojik tepkiye neden olur . DNA aşıları, "daha geniş bir bağışıklık tepkisi tipini indükleme yeteneği" de dahil olmak üzere, geleneksel aşılara göre teorik avantajlara sahiptir. Veteriner kullanımı için birkaç DNA aşısı test edilmiştir . Bazı durumlarda hayvanlarda hastalıktan korunma sağlandı, bazılarında ise sağlanamadı. İnsanlarda viral, bakteriyel ve paraziter hastalıkların yanı sıra kanserlere yönelik yaklaşım üzerine araştırmalar devam etmektedir. Ağustos 2021'de Hintli yetkililer ZyCoV-D'ye acil durum onayı verdi . Cadila Healthcare tarafından geliştirilen , insanlar için onaylanan ilk DNA aşısıdır.

Tarih

Geleneksel aşılar ya bir patojenden spesifik antijenler ya da aşılanmış organizmada bir bağışıklık tepkisini uyaran zayıflatılmış virüsler içerir. DNA aşıları, bir antijenin hücresel üretimini ( protein biyosentezi ) kodlayan bir genetik bilgi (DNA veya RNA) içerdiklerinden , genetik aşıların üyeleridir . DNA aşıları, bir patojenden spesifik antijenleri kodlayan DNA içerir. DNA vücuda enjekte edilir ve normal metabolik süreçleri, aldıkları plazmitteki genetik koda dayalı proteinleri sentezleyen hücreler tarafından alınır. Bu proteinler, bakteri veya virüslerin karakteristiği olan amino asit dizilerinin bölgelerini içerdiğinden, yabancı olarak tanınırlar ve konakçı hücreler tarafından işlenip yüzeylerinde görüntülendiklerinde, bağışıklık sistemi uyarılır ve bu da bağışıklık tepkilerini tetikler. Alternatif olarak, hücre girişini kolaylaştırmak için DNA protein içinde kapsüllenebilir. Bu kapsid proteini DNA'ya dahil edilirse , ortaya çıkan aşı, canlı bir aşının potensini geri dönüş riski olmadan birleştirebilir.

1983'te New York Sağlık Departmanından Enzo Paoletti ve Dennis Panicali, sıradan çiçek hastalığı aşısını diğer hastalıkları önleyebilecek aşılara dönüştürmek için genetik mühendisliği kullanarak rekombinant DNA aşıları üretmek için bir strateji geliştirdiler . Diğer virüslerden (yani Herpes simpleks virüsü , hepatit B ve grip ) bir gen ekleyerek sığır çiçeği virüsünün DNA'sını değiştirdiler . 1993'te Jeffrey Ulmer ve Merck Araştırma Laboratuarlarındaki çalışma arkadaşları, bir grip antijenini kodlayan plazmit DNA ile farelere doğrudan enjeksiyonun, hayvanları daha sonra influenza virüsü ile deneysel enfeksiyona karşı koruduğunu gösterdi. 2016 yılında Zika virüsü için bir DNA aşısı , Ulusal Sağlık Enstitülerinde insanlarda test edilmeye başlandı . Çalışmanın yaşları 18 ile 35 arasında değişen 120 deneği içermesi planlandı. Ayrı ayrı, Inovio Pharmaceuticals ve GeneOne Life Science , Miami'de Zika'ya karşı farklı bir DNA aşısının testlerine başladı. NIH aşısı, yüksek basınç altında üst kola enjekte edilir. Aşıların hacim olarak üretilmesi Ağustos 2016 itibariyle çözümsüz kaldı. HIV'i önlemek için DNA aşıları için klinik denemeler devam ediyor.

Ağustos 2021'de Hintli yetkililer ZyCoV-D'ye acil durum onayı verdi. Cadila Healthcare tarafından geliştirilen , COVID-19'a karşı ilk DNA aşısıdır .

Uygulamalar

2021 itibariyle, Amerika Birleşik Devletleri'nde insan kullanımı için hiçbir DNA aşısı onaylanmamıştır. Birkaç deneysel deneme, hastalığa karşı koruma sağlayacak kadar güçlü bir tepki uyandırdı ve tekniğin yararlılığı insanlarda kanıtlanmayı bekliyor. Atları Batı Nil virüsünden korumak için veteriner DNA aşısı onaylandı. Antivenom serumları geliştirmenin bir yolu olarak DNA bağışıklaması da araştırılmaktadır. DNA ile bağışıklama, monoklonal antikor indüksiyonu için bir teknoloji platformu olarak kullanılabilir.

Avantajlar

  • Enfeksiyon riski yok
  • Her iki Antijen sunumu MHC sınıf I ve sınıf II molekülleri
  • Tip 1 veya tip 2'ye karşı T hücresi tepkisini polarize edin
  • İlgilenilen antijene odaklanan bağışıklık yanıtı
  • Geliştirme ve üretim kolaylığı
  • Depolama ve nakliye için kararlılık
  • Maliyet etkinliği
  • Peptit sentezi, rekombinant proteinlerin ekspresyonu ve saflaştırılması ve toksik adjuvanların kullanımı ihtiyacını ortadan kaldırır
  • İmmünojenin uzun süreli kalıcılığı
  • İn vivo ekspresyon, proteinin normal ökaryotik yapıya daha yakından benzemesini sağlar ve beraberindeki translasyon sonrası modifikasyonlar

Dezavantajları

  • Protein immünojenleriyle sınırlıdır (bakteriyel polisakkaritler gibi protein bazlı olmayan antijenler için kullanışlı değildir)
  • Bakteri ve parazit proteinlerinin atipik işlenmesi için potansiyel
  • Beyin hücreleri gibi hedef olmayan hücreleri transfekte etmek için plazmid DNA nanoparçacıklarının burun spreyi uygulaması kullanıldığında potansiyel
  • Aynı tesiste farklı türlerde canlı aşılar üretilirken çapraz kontaminasyon

plazmit vektörleri

vektör tasarımı

DNA aşıları, yüksek ekspresyon vektörleri kullanıldığında en iyi bağışıklık tepkisini ortaya çıkarır. Bunlar, ilgili genin (veya tamamlayıcı DNA'nın ) in vivo transkripsiyonunu ve translasyonunu yürütmek için genellikle güçlü bir viral promotörden oluşan plazmitlerdir . Intron A bazen mRNA stabilitesini geliştirmek ve dolayısıyla protein ekspresyonunu arttırmak için dahil edilebilir . Plazmitler ayrıca, sığır büyüme hormonu veya tavşan beta-globulin poliadenilasyon dizileri gibi güçlü bir poliadenilasyon /transkripsiyonel sonlandırma sinyali içerir . Polisistronik vektörler (ilgilenen birden fazla gen ile) bazen birden fazla immünojeni ifade etmek veya bir immünojeni ve bir immün sistemi uyarıcı proteini ifade etmek için yapılandırılır.

Yaklaşık 200 K bp'ye kadar nispeten küçük genetik kod taşıyan plazmit  , immünojenin ifade edildiği “araç” olduğundan, maksimum protein ifadesi için vektör tasarımının optimize edilmesi esastır. Protein ekspresyonunu arttırmanın bir yolu, ökaryotik hücreler için patojenik mRNA'ların kodon kullanımını optimize etmektir . Patojenler genellikle hedef türlerden farklı AT içeriğine sahiptir, bu nedenle immünojenin gen dizisini hedef türlerde daha yaygın olarak kullanılan kodonları yansıtacak şekilde değiştirmek ifadesini iyileştirebilir.

Diğer bir husus ise, organizatörün seçimidir . SV40 araştırma ile tahrik vektörler gösterene kadar promotör geleneksel olarak kullanılan edildi Rous Sarcoma Virüsü (RSV) promoteri çok daha yüksek ekspresyon oranları. Daha yakın zamanlarda, sitomegalovirüs (CMV) ani erken promotörü ve retroviral cis-etkili transkripsiyonel elemanın kullanılmasıyla model sistemlerde ekspresyon ve immünojenisite daha da arttırılmıştır . Ekspresyon oranlarını iyileştirmek için ilave modifikasyonlar, arttırıcı diziler, sentetik intronlar , adenovirüs üçlü lider (TPL) dizileri ve poliadenilasyon ve transkripsiyonel sonlandırma dizilerindeki modifikasyonları içerir. DNA aşısı plazmitinin bir örneği, SV40 promotörünü kullanan pVAC'dir .

Yapısal kararsızlık fenomeni, plazmit üretimi, DNA aşılaması ve gen tedavisi için özellikle önemlidir. Plazmit omurgasına ait aksesuar bölgeleri, çok çeşitli yapısal kararsızlık fenomenine dahil olabilir. Genetik kararsızlığın iyi bilinen katalizörleri, ticari olarak temin edilebilen birçok klonlama ve ekspresyon vektöründe göze çarpan doğrudan, ters çevrilmiş ve tandem tekrarları içerir. Bu nedenle, yabancı kodlamayan omurga dizilerinin azaltılması veya tamamen ortadan kaldırılması, bu tür olayların meydana gelme eğilimini ve sonuç olarak genel plazmitin rekombinojenik potansiyelini belirgin bir şekilde azaltacaktır.

Plazmitlerin mekanizması

Plazmit kendisini transfekte edilmiş hücre çekirdeğine yerleştirdikten sonra, yabancı bir antijenin peptit dizisini kodlar. Yüzeyinde hücre, yabancı antijeni hem histo-uyumluluk kompleksi (MHC) sınıf I hem de sınıf II molekülleri ile gösterir. Antijen sunan hücre daha sonra lenf düğümlerine gider ve antijen peptitini ve kostimülatör molekül sinyalini T hücresine sunarak bağışıklık tepkisini başlatır.

Aşı ekleme tasarımı

İmmünojenler, antikor veya sitotoksik T-hücre yanıtlarını iyileştirmek için çeşitli hücresel bölmelere hedeflenebilir. Salgılanan veya plazma zarına bağlı antijenler, sitozolik antijenlere göre antikor yanıtlarını indüklemede daha etkilidir, sitotoksik T-hücre yanıtları, antijenleri sitoplazmik bozunma için hedefleyerek ve ardından ana doku uyumluluk kompleksi (MHC) sınıf I yoluna girerek geliştirilebilir . Bu genellikle N-terminal ubiquitin sinyallerinin eklenmesiyle gerçekleştirilir .

Konformasyon protein aynı zamanda antikor yanıtları etkiler. “Sıralı” yapılar (viral parçacıklar gibi) sırasız yapılardan daha etkilidir. Farklı patojenlerden gelen minigen dizileri (veya MHC sınıf I epitopları ), özellikle bir TH epitopu da dahil edilmişse, bazı patojenlere sitotoksik T-hücresi yanıtlarını yükseltir.

Teslimat

DNA aşısı ve Gen tedavisi teknikleri benzerdir.

DNA aşıları, hayvan dokularına birçok yöntemle dahil edilmiştir. 1999'da en popüler iki yaklaşım salin içine DNA enjeksiyonuydu : standart bir deri altı iğnesi kullanarak veya bir gen tabancası kullanarak . Aradan geçen yıllarda birkaç başka teknik belgelenmiştir.

tuzlu su enjeksiyonu

Salin enjeksiyonu normalde iskelet kasında intramüsküler (IM) veya intradermal (ID) olarak gerçekleştirilir ve DNA'yı hücre dışı boşluklara iletir. Bu, 1) elektroporasyon ; 2) bupivakain gibi miyotoksinlerle kas liflerine geçici olarak zarar vererek ; veya 3) hipertonik tuzlu su veya sakaroz çözeltileri kullanılarak . Bu yönteme verilen bağışıklık tepkileri, iğne tipi, iğne hizalaması, enjeksiyon hızı, enjeksiyon hacmi, kas tipi ve alıcının yaşı, cinsiyeti ve fizyolojik durumu gibi faktörlerden etkilenebilir.

gen silahı

Gen tabancası iletimi, hızlandırıcı olarak sıkıştırılmış helyum kullanarak altın veya tungsten mikropartiküller üzerinde emilen plazmit DNA'yı (pDNA) hedef hücrelere balistik olarak hızlandırır.

Mukozal yüzey teslimi

Alternatifler , nazal ve akciğer mukozası gibi mukozal yüzeyler üzerine çıplak DNA'nın aerosol damlatılmasını ve pDNA'nın göz ve vajinal mukozaya topikal olarak verilmesini içeriyordu . Mukozal yüzey iletimi ayrıca katyonik lipozom -DNA preparasyonları, biyolojik olarak parçalanabilen mikroküreler, bağırsak mukozasına oral uygulama için zayıflatılmış Salmonalla , Shigella veya Listeria vektörleri ve rekombinant adenovirüs vektörleri kullanılarak elde edilmiştir.

polimer araç

DNA aşısı dağıtımı için bakteri hücresi ve sentetik polimerlerden oluşan bir hibrit araç kullanılmıştır. Bir E. coli iç çekirdeği ve poli(beta-amino ester) dış kaplaması , hücresel alım ve içselleştirme, fagozomal kaçış ve hücre içi kargo konsantrasyonunu içeren antijen sunan hücre gen teslimi ile bağlantılı engelleri ele alarak verimliliği artırmak için sinerjistik olarak işlev görür . Farelerde test edilen hibrit vektörün bağışıklık tepkisini indüklediği bulundu.

ELI bağışıklama

DNA aşılamasına başka bir yaklaşım, ekspresyon kütüphanesi immünizasyonudur (ELI). Bu tekniği kullanarak, potansiyel olarak bir patojenden gelen tüm genler, zayıflatılması veya kültürü zor olan patojenler için faydalı olabilecek bir kerede verilebilir. ELI, hangi genlerin koruyucu bir tepki oluşturduğunu belirlemek için kullanılabilir. Bu test edilmiştir Mycoplasma pulmonis , bir murin nispeten küçük bir akciğer patojeni genomu . Kısmi ifade kitaplıkları bile sonraki zorluklara karşı koruma sağlayabilir.

Yararlı tablo karşılaştırması

Tablo 2. Plazmid DNA teslim yöntemlerinin özeti
Teslimat yöntemi DNA'nın formülasyonu Hedef doku DNA miktarı
parenteral Enjeksiyon (hipodermik iğne) Tuzlu su içinde sulu çözelti IM (iskelet); kimlik ; ( İV , subkutan ve intraperitoneal , değişken başarı ile) Büyük miktarlarda (yaklaşık 100-200 μg)
gen silahı DNA kaplı altın boncuklar ED (karın derisi); vajinal mukoza; cerrahi olarak maruz kalan kas ve diğer organlar Küçük miktarlar (16 ng kadar az)
Pnömatik (jet) enjeksiyon sulu çözelti ED Çok yüksek (300 μg'a kadar)
Güncel uygulama sulu çözelti Oküler; intravajinal Küçük miktarlar (100 μg'a kadar)
sitofektin aracılı Lipozomlar (katyonik); mikroküreler; rekombinant adenovirüs vektörleri; zayıflatılmış Shigella vektörü; aerosol haline getirilmiş katyonik lipid formülasyonları BEN; IV (dokuları sistemik olarak transfekte etmek için); intraperitoneal; bağırsak mukozasına oral bağışıklama; burun/akciğer mukoza zarları değişken
Tablo 3. Yaygın olarak kullanılan DNA aşısı dağıtım yöntemlerinin avantajları ve dezavantajları
Teslimat yöntemi Avantaj dezavantaj
Kas içi veya intradermal enjeksiyon
  • Özel teslimat mekanizması yok
  • Kalıcı veya yarı kalıcı ifade
  • pDNA vücutta hızla yayılır
  • Kas dokusunun morfolojisi nedeniyle alım için verimsiz bölge
  • Nispeten büyük miktarlarda kullanılan DNA
  • Th1 yanıtı gerekli yanıt olmayabilir
gen silahı
  • DNA doğrudan hücrelere bombalandı
  • Küçük miktarlarda DNA
  • Th2 yanıtı gerekli yanıt olmayabilir
  • Taşıyıcı olarak inert parçacıklar gerektirir
jet enjeksiyon
  • Parçacık gerekmez
  • DNA, cilt yüzeyinin mm ila cm altındaki hücrelere iletilebilir
  • Yüksek basınçlı atılmadan sonra DNA'nın önemli ölçüde kesilmesi
  • 10 kat daha düşük ifade ve daha düşük bağışıklık tepkisi
  • Büyük miktarda DNA gerektirir (300 μg'a kadar)
Lipozom aracılı teslimat
  • Yüksek düzeyde bağışıklık tepkisi oluşturulabilir
  • İntravenöz olarak verilen pDNA'nın transfeksiyonunu artırabilir
  • İntravenöz olarak verilen lipozom-DNA kompleksleri potansiyel olarak tüm dokuları transfekte edebilir
  • İntranazal olarak verilen lipozom-DNA kompleksleri, distal mukozanın yanı sıra nazal mukozada ekspresyona ve IgA antikorlarının oluşumuna neden olabilir.
  • toksisite
  • Serumda etkisizlik
  • Hastalık riski veya bağışıklık reaksiyonları

Dozaj

Dağıtım yöntemi, etkili bir bağışıklık tepkisini yükseltmek için gereken dozu belirler. Salin enjeksiyonları, 10 μg ila 1 mg arasında değişen miktarlarda DNA gerektirirken, gen tabancası teslimatları 100 ila 1000 kat daha az gerektirir. Genellikle 0.2 μg – 20 μg gereklidir, ancak 16 ng kadar düşük miktarlar rapor edilmiştir. Bu miktarlar türlere göre değişir. Örneğin fareler, primatlardan yaklaşık 10 kat daha az DNA gerektirir . Salin enjeksiyonları daha fazla DNA gerektirir çünkü DNA, hedef dokunun (normalde kas) hücre dışı boşluklarına iletilir, burada vücut tarafından alınmadan önce fiziksel engelleri ( bazal lamina ve büyük miktarda bağ dokusu gibi ) aşması gerekir. gen tabancası, DNA'yı doğrudan hücrelere yönlendirir/zorlar, bu da daha az "israf" ile sonuçlanır.

Bağışıklık yanıtı

Yardımcı T hücre yanıtları

Antijen sunumu, T hücrelerini "sitotoksik" CD8+ hücreleri veya "yardımcı" CD4+ hücreleri olmaları için uyarır. Sitotoksik hücreler, yüzeylerinde belirli yabancı veya anormal moleküller taşıyan diğer hücrelere doğrudan saldırır. Yardımcı T hücreleri veya Th hücreleri, diğer hücrelerle iletişim kurarak bağışıklık tepkilerini koordine eder. Çoğu durumda, T hücreleri bir antijeni ancak bir hücrenin yüzeyinde vücudun kendi MHC'lerinden biri veya majör histo-uyumluluk kompleksi moleküllerinden biri tarafından taşınırsa tanır.

DNA immünizasyonu, lenfoproliferasyon ve çeşitli sitokin profillerinin oluşturulması dahil olmak üzere çoklu TH yanıtlarını artırabilir . DNA aşılarının önemli bir avantajı, T hücresi yardımının türünü bir TH1 veya TH2 yanıtına yönlendirmek için manipüle edilebilme kolaylığıdır. Her türün kendine özgü lenfokin ve kemokin ekspresyonu kalıpları , spesifik immünoglobulin türleri , lenfosit kaçakçılığı kalıpları ve doğuştan gelen bağışıklık tepkileri türleri vardır .

Diğer T hücresi yardımı türleri

Yükseltilen T-hücresi yardımının türü, verme yönteminden ve ifade edilen immünojen türünden ve ayrıca farklı lenfoid bölmelerin hedeflenmesinden etkilenir. Genel olarak, tuzlu su iğnesi enjeksiyonları (IM veya ID), TH1 yanıtlarını indükleme eğilimindeyken, gen tabancası verilmesi TH2 yanıtlarını yükseltir. Bu, hücre içi ve plazma zarına bağlı antijenler için geçerlidir, ancak verme yönteminden bağımsız olarak TH2 yanıtları üretiyor gibi görünen salgılanan antijenler için geçerli değildir.

Genellikle yükseltilen T-hücresi yardımının türü zamanla stabildir ve normal olarak naif bir numunede karşıt tepki tipini ortaya çıkaran sonraki bağışıklamalardan sonra veya tehdit edildiğinde değişmez. Ancak Mor ve ark. . (1995) fareleri, fare sıtma paraziti Plasmodium yoelii'nin (PyCSP) sirkumsporozoit proteinini kodlayan pDNA ile bağışıklaştırdı ve güçlendirdi ve ilk TH2 yanıtının, artırmadan sonra bir TH1 yanıtına dönüştüğünü buldu.

Farklı T hücresi yardımı türleri için temel

Bu farklı yöntemlerin nasıl çalıştığı, eksprese edilen antijen formları ve T hücresi yardımının farklı profilleri anlaşılmamıştır. IM enjeksiyonunda kullanılan nispeten büyük miktarlardaki DNA'nın TH1 yanıtlarının indüklenmesinden sorumlu olduğu düşünülmüştür. Bununla birlikte, kanıtlar TH tipinde doza bağlı farklılıklar göstermemektedir. Yükseltilen T hücresi yardımının türü, antijen sunan hücrelerin farklılaşmış durumu tarafından belirlenir . Dendritik hücreler , IL-12 (TH1 hücre gelişimini destekler) veya IL-4 (TH2 yanıtlarını destekler ) salgılamak üzere farklılaşabilir . İğne ile enjekte edilen pDNA , daha sonra TH1 sitokin üretimi için farklılaşması için stimüle edilen dendritik hücreye endositoz yapılır , bu arada gen tabancası DNA'yı doğrudan hücreye bombalar ve böylece TH1 stimülasyonunu atlar.

Polarize T hücre yardımının pratik kullanımları

T-hücre yardımındaki polarizasyon, alerjik tepkileri ve otoimmün hastalıkları etkilemede faydalıdır . Otoimmün hastalıklarda amaç, kendi kendine zarar veren TH1 yanıtını (ilişkili sitotoksik T hücre aktivitesiyle birlikte) yıkıcı olmayan bir TH2 yanıtına kaydırmaktır. Bu, preklinik modellerde istenen yanıt türü için hastalık öncesi hazırlamada başarıyla uygulanmıştır ve yerleşik bir hastalık için yanıtı değiştirmede bir ölçüde başarılıdır.

Sitotoksik T-hücre yanıtları

DNA aşılarının avantajlarından biri, canlı aşılarla ilişkili doğal risk olmaksızın sitotoksik T lenfositleri (CTL) indükleyebilmeleridir . CTL tepkileri, doğal enfeksiyonu taklit ediyormuş gibi görünen bir şekilde, immünodominant ve immünoresesif CTL epitoplarının yanı sıra alt baskın CTL epitoplarına karşı yükseltilebilir . Bu, CTL epitoplarını ve bağışıklık sağlamadaki rollerini değerlendirmede faydalı bir araç olabilir.

Sitotoksik T hücreleri , MHC sınıf I molekülleri ile kompleks oluşturan küçük peptitleri (8-10 amino asit ) tanır . Bu peptitler, parçalanan ve endoplazmik retikulum (ER) içindeki yeni oluşan MHC sınıf I molekülüne verilen endojen sitozolik proteinlerden türetilir . Gen ürünlerini doğrudan ER'ye hedeflemek (bir amino-terminal yerleştirme dizisinin eklenmesiyle ) bu nedenle CTL yanıtlarını arttırmalıdır. Bu, influenza proteinlerini eksprese eden rekombinant aşı virüsleri kullanılarak başarıyla gösterildi , ancak ilke DNA aşılarına da uygulanabilir olmalıdır. Ubikuitin sinyal dizilerinin eklenmesiyle hücre içi bozunma (ve dolayısıyla MHC sınıf I yoluna giriş) için antijenleri hedeflemenin veya diğer sinyal dizilerinin mutasyonunun, CTL yanıtlarını arttırmada etkili olduğu gösterildi.

CTL yanıtları, influenza nükleoproteinine karşı DNA aşıları için B7-1 veya B7-2 gibi ortak uyarıcı moleküller veya murin sıtması modeli P. yoelii'ye karşı DNA aşıları için GM-CSF gibi ortak uyarıcı moleküller ile birlikte aşılama yoluyla güçlendirilebilir . Birlikte uyarıcı moleküller IL-12 ve TCA3'ü kodlayan plazmitlerle birlikte aşılamanın, HIV-1 ve influenza nükleoprotein antijenlerine karşı CTL aktivitesini arttırdığı gösterilmiştir.

Humoral (antikor) yanıtı

Bir antikor ve antijenlerin şematik diyagramı

DNA aşıları tarafından ortaya çıkarılan antikor tepkileri, antijen tipi dahil olmak üzere birçok değişkenden etkilenir; antijen konumu (yani hücre içi vs. salgılanmış); sayı, sıklık ve bağışıklama dozu; antijen dağıtım yeri ve yöntemi.

Antikor yanıtının kinetiği

Tek bir DNA enjeksiyonundan sonraki hümoral tepkiler, rekombinant bir protein ile tek bir enjeksiyondan sonra çok daha uzun ömürlü olabilir. Hepatit B virüsü (HBV) zarf proteinine (HBsAg) karşı antikor tepkileri , takviye olmaksızın 74 haftaya kadar sürdürülürken , farelerde gen tabancası verilmesinden sonra influenza hemaglutinin'e karşı koruyucu tepkinin ömür boyu sürdürüldüğü gösterilmiştir. Antikor salgılayan hücreler , uzun süreli antikor üretimi için kemik iliğine ve dalağa göç eder ve genellikle bir yıl sonra orada lokalize olur.

Doğal (viral) enfeksiyon, rekombinant protein ile bağışıklama ve pDNA ile bağışıklama tarafından oluşturulan antikor tepkilerinin karşılaştırmaları Tablo 4'te özetlenmiştir. DNA tarafından yükseltilen antikor tepkileri, doğal enfeksiyon veya rekombinant protein bağışıklamasının meydana geldiğinden çok daha yavaş yükselir. Farelerde en yüksek titrelere ulaşmak için 12 hafta kadar gerekli olabilir, ancak güçlendirme aralığı azaltabilir. Bu yanıt, muhtemelen, antikor yanıtının hem birincil hem de ikincil fazlarını destekleyen, birkaç hafta boyunca ifade edilen düşük antijen seviyelerine bağlıdır. HBV küçük ve orta zarf proteinini eksprese eden DNA aşısı, kronik hepatitli yetişkinlere enjekte edildi. Aşı, spesifik interferon gama hücresi üretimi ile sonuçlandı. Ayrıca orta zarf protein antijenleri için spesifik T hücreleri geliştirilmiştir. Hastaların bağışıklık yanıtı, HBV enfeksiyonunu kontrol edecek kadar güçlü değildi.

Tablo 4. DNA bağışıklamaları, protein aşılamaları ve viral enfeksiyonlar tarafından yükseltilen T'ye bağlı antikor yanıtlarının karşılaştırması
  Bağışıklama Yöntemi
DNA aşısı rekombinant protein Doğal enfeksiyon
İndükleyici antijen miktarı ng μg ? (ng-μg)
Antijen sunum süresi birkaç hafta < 1 hafta birkaç hafta
Antikor yanıtının kinetiği yavaş yükselme hızlı yükseliş hızlı yükseliş
Yüksek aviditeli IgG ve ASC'nin kemik iliğine göçü elde etmek için yapılan aşı sayısı bir 2 bir
Ab izotipi (fare modelleri) C'-bağımlı veya C'-bağımsız C'-bağımlı C'-bağımsız

Ek olarak, DNA aşılaması ile yükseltilen spesifik antikorların titreleri, bir rekombinant protein ile aşılamadan sonra elde edilenlerden daha düşüktür. Bununla birlikte, DNA bağışıklama ile indüklenen antikorlar, rekombinant protein ile indüklenen antikorlardan daha doğal epitoplara daha fazla afinite gösterir. Başka bir deyişle, DNA ile bağışıklama, niteliksel olarak üstün bir tepkiyi indükler. DNA ile bir aşılamadan sonra antikorlar indüklenebilir, oysa rekombinant protein aşıları genellikle bir takviye gerektirir. DNA immünizasyonu, immün yanıtın TH profilini ve dolayısıyla doğal enfeksiyon veya rekombinant protein immünizasyonu ile mümkün olmayan antikor izotipini saptırmak için kullanılabilir. DNA tarafından üretilen antikor tepkileri, hazırlayıcı bir araç olarak faydalıdır. Örneğin, reaktifler olarak kullanılmak üzere poliklonal ve monoklonal antikorlar üretilebilir.

DNA ile yükseltilmiş bağışıklık tepkileri için mekanik temel

DNA alım mekanizması

DNA alımı ve ardından ekspresyon ilk olarak kas hücrelerinde in vivo olarak gösterildiğinde , bu hücrelerin geniş T-tübül ağları nedeniyle benzersiz oldukları düşünülmüştür. Kullanma elektron mikroskobu , bu DNA alımı kolaylaştırılmıştır olduğu ileri sürülmüştür , kaveol (ya da olmayan, klatrin kaplı pitlerde). Bununla birlikte, sonraki araştırmalar, diğer hücrelerin ( keratinositler , fibroblastlar ve epitelyal Langerhans hücreleri gibi ) de DNA'yı içselleştirebileceğini ortaya koydu . DNA alımının mekanizması bilinmemektedir.

İki teori hakimdir - DNA'nın in vivo alımının spesifik olmayan bir şekilde, fago veya pinositoza benzer bir yöntemle veya spesifik reseptörler yoluyla gerçekleştiği. Bunlar bir 30kDa yüzey reseptörü veya makrofaj süpürücü reseptörleri içerebilir . 30kDa yüzey reseptörü, spesifik olarak 4500-bp DNA fragmanlarına (daha sonra içselleştirilir) bağlanır ve profesyonel APC'ler ve T-hücrelerinde bulunur. Makrofaj süpürücü reseptörleri, poli ribonükleotitler dahil olmak üzere çeşitli makromoleküllere bağlanır ve bu nedenle DNA alımı için adaylardır. Reseptör aracılı DNA alımı, poliguanilat dizilerinin mevcudiyeti ile kolaylaştırılabilir . Gen tabancası dağıtım sistemleri, katyonik lipozom paketleme ve diğer dağıtım yöntemleri bu giriş yöntemini atlar, ancak bunun anlaşılması, hayvancılıkta önemli olabilecek maliyetleri düşürmede (örneğin sitofektin gereksinimini azaltarak) faydalı olabilir.

Kemik iliği kaynaklı hücreler tarafından antijen sunumu

Bir dendritik hücre.

Kimerik fareler kullanılarak yapılan çalışmalar , antijenin, dendritik hücreler, makrofajlar ve profesyonel antijen sunan hücreler (APC) olarak adlandırılan özel B-hücrelerini içeren kemik iliği kaynaklı hücreler tarafından sunulduğunu göstermiştir . Deriye gen tabancası aşılamasından sonra, transfekte edilmiş Langerhans hücreleri , antijenleri sunmak için drene olan lenf düğümüne göç eder . IM ve ID enjeksiyonlarından sonra, dendritik hücreler drene olan lenf düğümünde antijen sunar ve periferik kanda transfekte makrofajlar bulunur.

Dendritik hücrelerin veya makrofajların doğrudan transfeksiyonunun yanı sıra, IM, ID ve gen tabancası DNA teslimatlarını takiben çapraz hazırlama meydana gelir. Çapraz hazırlama, kemik iliğinden türetilen bir hücre, MHC sınıf 1 bağlamında başka bir hücrede sentezlenen proteinlerden peptitler sunduğunda meydana gelir. Bu, sitotoksik T hücresi yanıtlarını hazırlayabilir ve tam bir birincil bağışıklık yanıtı için önemli gibi görünmektedir.

Hedef site rolü

IM ve ID DNA teslimi, bağışıklık tepkilerini farklı şekilde başlatır. Deride keratinositler, fibroblastlar ve Langerhans hücreleri antijenleri alır ve eksprese eder ve birincil antikor yanıtının indüklenmesinden sorumludur. Transfekte edilmiş Langerhans hücreleri deriden (12 saat içinde) sekonder B- ve T-hücre yanıtlarını başlattıkları drenaj lenf düğümüne göç eder. İskelet kasında çizgili kas hücreleri en sık transfekte edilir, ancak immün yanıtta önemsiz görünmektedir. Bunun yerine, IM aşılanmış DNA dakikalar içinde drene olan lenf düğümüne "yıkar", burada distal dendritik hücreler transfekte olur ve ardından bir bağışıklık tepkisi başlatır. Transfekte edilmiş miyositler, profesyonel APC kaçakçılığı için bir antijen “rezervuarı” görevi görüyor gibi görünüyor.

Bağışıklık yanıtının sürdürülmesi

DNA aşılaması , güçlü B hücresi uyarıcıları olan foliküler dendritik hücreler (FDC) üzerinde antijen-antikor komplekslerinin görüntülenmesi yoluyla etkili bir bağışıklık belleği oluşturur . T-hücreleri benzer, germinal merkez dendritik hücreler tarafından uyarılabilir. FDC, bir bağışıklık belleği oluşturabilmektedir, çünkü antikor üretimi, antijenin uzun süreli ekspresyonunu "örtüşmektedir" ve antijen-antikor immünokomplekslerinin FDC tarafından oluşturulmasına ve görüntülenmesine izin vermektedir.

interferonlar

Hem yardımcı hem de sitotoksik T hücreleri, interferon salgılayarak viral enfeksiyonları kontrol edebilir. Sitotoksik T hücreleri genellikle viral olarak enfekte olmuş hücreleri öldürür. Bununla birlikte, hücreyi öldürmeyen, ancak viral bileşenlerin ekspresyonunu aşağı regüle ederek viral enfeksiyonu sınırlayan IFN-y ve TNF-a gibi antiviral sitokinleri salgılamak üzere de uyarılabilirler . DNA aşıları, yıkıcı olmayan IFN aracılı kontrol yoluyla viral enfeksiyonları engellemek için kullanılabilir. Bu, hepatit B için gösterilmiştir. IFN-y, sıtma enfeksiyonlarının kontrolünde kritik derecede önemlidir ve sıtma önleyici DNA aşıları için bir değerlendirmedir.

Bağışıklık yanıt modülasyonu

sitokin modülasyonu

Etkili bir aşı, belirli bir patojen için uygun bir bağışıklık tepkisi oluşturmalıdır. DNA aşıları, T hücre yardımını TH1 veya TH2 profillerine doğru polarize edebilir ve gerektiğinde CTL ve/veya antikor üretebilir. Bu, eksprese edilen antijenin formunda (yani hücre içi veya salgılanan), uygulama yönteminde ve yolunda veya dozda yapılan modifikasyonlarla gerçekleştirilebilir. Aynı zamanda, bağışıklık düzenleyici molekülleri, yani sitokinler, lenfokinler veya birlikte uyarıcı molekülleri kodlayan plazmit DNA'nın birlikte uygulanmasıyla da gerçekleştirilebilir . Bu "genetik adjuvanlar " şu şekilde uygulanabilir:

  • biri immünojeni, diğeri sitokini kodlayan 2 plazmit karışımı
  • boşluk bölgeleriyle ayrılmış tek bi- veya polisistronik vektör
  • plazmit kodlu kimera veya füzyon proteini

Genel olarak, proinflamatuar ajanların (çeşitli interlökinler , tümör nekroz faktörü ve GM-CSF gibi) ve TH2'yi indükleyen sitokinlerin birlikte uygulanması, antikor yanıtlarını arttırırken, proinflamatuar ajanlar ve TH1'i indükleyen sitokinler, hümoral yanıtları azaltır ve arttırır. sitotoksik tepkiler (viral korumada daha önemlidir). B7-1 , B7-2 ve CD40L gibi ortak uyarıcı moleküller bazen kullanılır.

Bu konsept, IL-10'u kodlayan pDNA'nın topikal uygulamasında uygulandı . B7-1'i (APC'ler üzerindeki bir ligand) kodlayan plazmit, tümör modellerinde bağışıklık tepkisini başarıyla geliştirdi. GM-CSF ve P. yoelii'nin sirkumsporozoit proteinini (PyCSP) kodlayan plazmitlerin karıştırılması, sonraki zorlamaya karşı korumayı arttırdı (buna karşın plazmit kodlu PyCSP tek başına yapmadı). GM-CSF'nin dendritik hücrelerin antijeni daha verimli bir şekilde sunmasına ve IL-2 üretimini ve TH hücresi aktivasyonunu arttırmasına neden olduğu ve böylece artan bağışıklık tepkisini yönlendirdiği öne sürülmüştür. Bu ayrıca bir pPyCSP ve PGM-CSF karışımı ile birinci prime edilmesi ile arttırılabilir, yeniden birleştirici bir ile takviye etme ile, ardından bir çiçek virüsü PyCSP eksprese. Bununla birlikte, GM-CSF (veya IFN-y veya IL-2) ve P. chabaudi merozoite yüzey proteini 1 (C-terminal)-hepatit B virüsü yüzey proteininin (PcMSP1-HBs) bir füzyon proteinini kodlayan plazmitlerin birlikte enjeksiyonu pPcMSP1-HBs'nin tek başına verilmesiyle elde edilen korumaya kıyasla, tehdide karşı korumayı ortadan kaldırdı.

Genetik adjuvanların avantajları, düşük maliyetli olmaları ve basit uygulamalarının yanı sıra, stabil olmayan rekombinant sitokinlerden ve potansiyel olarak toksik, "geleneksel" adjuvanlardan ( alum , kalsiyum fosfat , monofosforil lipid A, kolera toksini, katyonik ve mannan kaplı lipozomlar gibi) kaçınmalarıdır. , QS21 , karboksimetil selüloz ve ubenimix ). Bununla birlikte, uzun süreli sitokin ekspresyonunun potansiyel toksisitesi belirlenmemiştir. Ticari olarak önemli birçok hayvan türünde sitokin genleri tanımlanmamıştır ve izole edilmemiştir. Ek olarak, çeşitli plazmit kodlu sitokinler, bağışıklık sistemini teslim süresine göre farklı şekilde modüle eder. Örneğin, bazı sitokin plazmit DNA'ları en iyi şekilde immünojen pDNA'dan sonra verilir, çünkü ön veya birlikte verme spesifik yanıtları azaltabilir ve spesifik olmayan yanıtları artırabilir.

İmmünostimülatör CpG motifleri

Plazmit DNA'nın kendisinin bağışıklık sistemi üzerinde adjuvan bir etkisi olduğu görülmektedir. Bakteriyel olarak türetilen DNA, doğuştan gelen bağışıklık savunma mekanizmalarını, dendritik hücrelerin aktivasyonunu ve TH1 sitokinlerinin üretimini tetikleyebilir. Bunun nedeni, immün sistemi uyarıcı olan belirli CpG dinükleotit dizilerinin tanınmasıdır. CpG uyarıcı (CpG-S) dizileri, bakteri kaynaklı DNA'da ökaryotlardan yirmi kat daha sık meydana gelir. Bunun nedeni ökaryotların “CpG baskılaması” sergilemesidir – yani CpG dinükleotit çiftleri beklenenden çok daha az sıklıkla meydana gelir. Ek olarak, CpG-S dizileri hipometillenir. Bu, bakteriyel DNA'da sıklıkla meydana gelirken, ökaryotlarda meydana gelen CpG motifleri sitozin nükleotidinde metillenir. Buna karşılık, bir bağışıklık tepkisinin aktivasyonunu engelleyen nükleotid dizileri (CpG nötralize etme veya CpG-N olarak adlandırılır), ökaryotik genomlarda fazla temsil edilir. Optimum immün sistemi uyarıcı dizi, iki 5' pürin ve iki 3' pirimidin ile çevrili metillenmemiş bir CpG dinükleotittir . Ek olarak, bu immün sistemi uyarıcı heksamerin dışındaki komşu bölgeler, bağlanmayı ve hedef hücrelere alımını sağlamak için guanin açısından zengin olmalıdır .

Doğuştan gelen sistem, DNA kodlu proteine ​​karşı bir yanıt oluşturmak için adaptif bağışıklık sistemi ile birlikte çalışır. CpG-S dizileri, poliklonal B-hücresi aktivasyonunu ve sitokin ekspresyonu ve sekresyonunun yukarı regülasyonunu indükler. Uyarılmış makrofajlar IL-12, IL-18 , TNF-a, IFN-a, IFN-p ve IFN-y salgılarken, uyarılan B hücreleri IL-6 ve bir miktar IL-12 salgılar.

DNA aşılarının plazmit omurgasındaki CpG-S ve CpG-N dizilerinin manipülasyonu, kodlanmış antijene karşı bağışıklık tepkisinin başarısını sağlayabilir ve bağışıklık tepkisini bir TH1 fenotipine doğru yönlendirebilir. Bu, bir patojen koruma için bir TH yanıtı gerektiriyorsa yararlıdır. CpG-S dizileri ayrıca hem DNA hem de rekombinant protein aşılaması için değişken başarı oranlarıyla harici adjuvanlar olarak kullanılmıştır. Hipometillenmiş CpG motiflerine sahip diğer organizmalar, poliklonal B-hücre genişlemesinin uyarıldığını göstermiştir. Bunun arkasındaki mekanizma, basit metilasyondan daha karmaşık olabilir - hipometillenmiş murin DNA'sının bir bağışıklık tepkisi oluşturduğu bulunmamıştır.

İmmün sistemi uyarıcı CpG dizileri için kanıtların çoğu murin çalışmalarından gelmektedir. Bu verilerin diğer türlere ekstrapolasyonu dikkatli olmayı gerektirir - çöpçü reseptörlerinin bağlanma özgüllükleri türler arasında farklılık gösterdiğinden, tek tek türler farklı yan dizilimler gerektirebilir. Ek olarak, geviş getiren hayvanlar gibi türler, büyük gastrointestinal yüklerinden dolayı immün sistemi uyarıcı dizilere karşı duyarsız olabilir.

Alternatif güçlendirmeler

DNA ile hazırlanan bağışıklık tepkileri, rekombinant protein veya rekombinant poksvirüslerin uygulanmasıyla güçlendirilebilir. Rekombinant protein ile "prime-boost" stratejileri, HIV-1 zarf proteini gibi zayıf immünojenler için hem nötrleştirici antikor titresini hem de antikor aviditesini ve kalıcılığını başarıyla arttırdı. Rekombinant virüs takviyelerinin, DNA ile hazırlanmış CTL tepkilerini arttırmada çok verimli olduğu gösterilmiştir. DNA ile hazırlama, bağışıklık tepkisini gerekli immünojene odaklarken, rekombinant virüs ile güçlendirme, daha fazla miktarda eksprese edilmiş antijen sağlayarak spesifik CTL tepkilerinde büyük bir artışa yol açar.

Prime-boost stratejileri, bir dizi çalışmada sıtma tehdidine karşı koruma sağlamada başarılı olmuştur. Plasmodium yoelii sirkumsporozoit yüzey proteinini (PyCSP) kodlayan plazmit DNA'sı ile astarlanmış ve daha sonra aynı proteini eksprese eden bir rekombinant aşı virüsü ile güçlendirilmiş fareler, aşılanmış farelere göre önemli ölçüde daha yüksek antikor, CTL aktivitesi ve IFN-y seviyelerine ve dolayısıyla daha yüksek koruma seviyelerine sahipti. ve yalnızca plazmit DNA ile desteklendi. Bu, rekombinant aşı virüsü ile güçlendirmeden önce PyCSP ve murin GM-CSF'yi kodlayan bir plazmit karışımı ile prime edilerek daha da geliştirilebilir. İçin etkili bir ana-yükleme stratejisi maymun sıtma modeli S. knowlesi de gösterilmiştir. Rhesus maymunları , iki karaciğer evreli antijeni - sirkumsporozoit yüzey proteini (PkCSP) ve sporozoit yüzey proteini 2'yi (PkSSP2) - ve iki kan evresi antijeni - apikal merozoit yüzey proteini 1 (PkAMA1) ve merozoit yüzey proteini 1 (PkMSP1p42). Daha sonra, dört antijenin tümünü (ALVAC-4) kodlayan bir rekombinant canarypox virüsü ile güçlendirildiler. Bağışıklılaştırılmış maymunlar, sporozoitlere ve enfekte olmuş eritrositlere karşı antikorlar ve PkCSP'den gelen peptitlere karşı IFN-y salgılayan T hücresi tepkileri geliştirdi. Sporozoit tehdidine karşı kısmi koruma sağlandı ve kontrol maymunlarına kıyasla ortalama parazitemi önemli ölçüde azaldı. Bu modeller, insanlarda P. falciparum için ekstrapolasyon için ideal olmasa da , klinik öncesi çalışmalarda önemli olacaktır.

Bağışıklık tepkilerini geliştirmek

DNA

DNA immünizasyonunun etkinliği, DNA'yı bozunmaya karşı stabilize ederek ve DNA'nın antijen sunan hücrelere verilmesinin etkinliğini artırarak geliştirilebilir . Bu, biyolojik olarak parçalanabilen katyonik mikropartiküllerin ( setiltrimetilamonyum bromür ile formüle edilmiş poli(laktid-ko-glikolid) gibi ) DNA ile kaplanmasıyla kanıtlanmıştır . Bu tür DNA kaplı mikropartiküller, özellikle alum ile karıştırıldığında, CTL'yi yükseltmede rekombinant virüsler kadar etkili olabilir. 300 nm çapındaki partiküller, antijen sunan hücreler tarafından alım için en verimli gibi görünmektedir.

alfavirüs vektörleri

DNA aşılama verimliliğini artırmak için rekombinant alfavirüs bazlı vektörler kullanılmıştır. İlgili antijeni kodlayan gen, yapısal genlerin yerini alarak ancak yapısal olmayan replikaz genlerini sağlam bırakarak alfavirüs replikonuna eklenir. Sindbis virüsü ve Semliki Orman virüsü rekombinant oluşturmak için kullanılmış olan alfavirüs replikonlanna . Geleneksel DNA aşılarından farklı olarak alfavirüs vektörleri, transfekte edilmiş hücreleri öldürür ve sadece geçici olarak eksprese edilir. Alfavirüs replikaz genleri, aşı ekine ek olarak ifade edilir. Alfavirüs replikonlarının bir bağışıklık tepkisini nasıl yükselttiği açık değildir, ancak bu vektör tarafından eksprese edilen yüksek protein seviyeleri, replikon kaynaklı sitokin tepkileri veya dendritik hücreler tarafından arttırılmış antijen alımına yol açan replikon kaynaklı apoptoz nedeniyle olabilir.

Ayrıca bakınız

Referanslar

daha fazla okuma