Hücresiz fetal DNA - Cell-free fetal DNA
Hücresiz fetal DNA ( cffDNA ), anne kanında serbestçe dolaşan fetal DNA'dır . Anne kanı venipunktür ile örneklenir . cffDNA analizi, ileri anne yaşındaki hamile kadınlar için sıklıkla istenen, invaziv olmayan bir doğum öncesi tanı yöntemidir . Doğumdan iki saat sonra, cffDNA anne kanında artık saptanamaz.
Arka plan
cffDNA, plasental trofoblastlardan kaynaklanır . Plasental mikropartiküller anne kan dolaşımına döküldüğünde fetal DNA parçalanır .
cffDNA fragmanları yaklaşık 200 baz çifti (bp) uzunluğundadır. Maternal DNA parçalarından önemli ölçüde daha küçüktürler. Boyuttaki fark, cffDNA'nın maternal DNA parçalarından ayırt edilmesini sağlar.
Anne kanındaki hücre içermeyen DNA'nın yaklaşık yüzde 11 ila 13.4'ü fetal kökenlidir. Miktar, bir hamile kadından diğerine büyük ölçüde değişir. cffDNA, beş ila yedi haftalık gebelikten sonra bulunur. Hamilelik ilerledikçe cffDNA miktarı artar. Anne kanındaki cffDNA miktarı doğumdan sonra hızla azalır. Doğumdan iki saat sonra, cffDNA anne kanında artık saptanamaz.
cffDNA analizi, mevcut tekniklere göre fetal durumların daha erken teşhisini sağlayabilir. Anne kanında cffDNA bulunduğundan, örnekleme spontan abortus riski taşımaz . cffDNA analizi, amniyosentez ve koryon villus örneklemesi gibi diğer tekniklerle aynı etik ve pratik sorunlara sahiptir .
cffDNA örneklemenin bazı dezavantajları arasında anne kanında düşük konsantrasyonda cffDNA bulunur; bireyler arasında cffDNA miktarındaki değişiklik; anne kanındaki cffDNA'ya kıyasla yüksek bir anne hücresiz DNA konsantrasyonu.
Yeni kanıtlar, kendiliğinden gebe kalanlara kıyasla IVF gebeliklerinde cffDNA testi başarısızlık oranının daha yüksek olduğunu, fetal fraksiyonun (maternal kan örneğinde fetal DNA'ya karşı maternal DNA oranı) daha düşük olduğunu ve trizomi 18, 13 ve SCA için PPV'nin azaldığını göstermektedir.
Laboratuvar yöntemleri
Genetik kusurlar için hücresiz fetal DNA taraması için bir takım laboratuvar yöntemleri geliştirilmiştir. Başlıcaları (1) toplu paralel av tüfeği dizilimi (MPSS), (2) hedefli büyük paralel dizileme (t-MPS) ve (3) tek nükleotid polimorfizmi (SNP) tabanlı yaklaşımdır.
Maternal periferik kan örneği, yaklaşık on haftalık gebelikte veneeksiyonla alınır.
cffDNA'nın ayrılması
Kan plazması , bir laboratuvar santrifüjü kullanılarak anne kan örneğinden ayrılır . cffDNA daha sonra izole edilir ve saflaştırılır. Bunu yapmak için standartlaştırılmış bir protokol, bilimsel literatürün değerlendirilmesi yoluyla yazılmıştır . cffDNA ekstraksiyonunda en yüksek verim "QIAamp DSP Virus Kit" ile elde edildi.
Maternal kan örneklerine formaldehit eklenmesi cffDNA verimini arttırır. Formaldehit, bozulmamış hücreleri stabilize eder ve bu nedenle maternal DNA'nın daha fazla salınımını engeller. Formaldehit ilavesiyle, anneden alınan bir kan örneğinden elde edilen cffDNA yüzdesi, ortalama yüzde 7,7 ile yüzde 0,32 ile yüzde 40 arasında değişir. Formaldehit ilavesi olmadan, elde edilen cffDNA'nın ortalama yüzdesi yüzde 20.2 olarak ölçülmüştür. Ancak diğer rakamlar yüzde 5 ile yüzde 96 arasında değişiyor.
cffDNA'nın geri kazanılması, DNA fragmanlarının uzunluğu ile ilgili olabilir. Fetal DNA'yı arttırmanın bir başka yolu, DNA parçalarının fiziksel uzunluğuna dayanmaktadır. Daha küçük parçalar, anne kan örneğindeki toplam hücresiz DNA'nın yüzde yetmişine kadarını temsil edebilir.
cffDNA'nın analizi
Gerçek zamanlı PCR'de, amplikonların birikimini izlemek için floresan problar kullanılır . Raportör floresan sinyali, üretilen amplikonların sayısıyla orantılıdır. En uygun gerçek zamanlı PCR protokolü, tespit edilecek belirli mutasyon veya genotipe göre tasarlanır. Nokta mutasyonları, alel spesifik probların kullanımı ile kalitatif gerçek zamanlı PCR ile analiz edilir . eklemeler ve silmeler , nicel gerçek zamanlı PCR kullanılarak dozaj ölçümleriyle analiz edilir.
cffDNA, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yoluyla babadan kalıtılan DNA dizilerinin bulunmasıyla saptanabilir .
Nicel gerçek zamanlı PCR
511 gebelikten alınan cffDNA'da cinsiyet belirleyici bölge Y geni (SRY) ve Y kromozomu kısa tandem tekrarı "DYS14", kantitatif gerçek zamanlı PCR (RT-qPCR) kullanılarak analiz edildi. Yedi haftalık veya daha fazla gebelik haftasında anneden kan alınan 403 gebeliğin 401'inde DNA'nın her iki segmenti de bulundu.
iç içe PCR
Kullanımı iç içe polimeraz zincir reaksiyonu (PCR iç içe) anne plazmadan cffDNA bir Y kromozomu belirli bir sinyal saptanarak cinsiyeti belirlemek için değerlendirilmiştir. Yuvalanmış PCR, 55 erkek fetüsün 53'ünü tespit etti. Dişi fetüsleri olan 25 kadından 3'ünün plazmasından alınan cffDNA, Y kromozomuna özgü sinyal içeriyordu. Duyarlılığı bu deneyde iç içe PCR yüzde 96'sı idi. Özgüllük yüzde 88 idi.
Dijital PCR
Mikroakışkan cihazlar , anne plazmasındaki cffDNA segmentlerinin gerçek zamanlı PCR'nin ötesinde bir doğrulukla nicelleştirilmesine izin verir. Nokta mutasyonları , heterozigotluk kaybı ve anöploidi tek bir PCR adımında tespit edilebilir. Dijital PCR, maternal kan plazması ile fetal DNA'yı multipleks bir şekilde ayırt edebilir .
av tüfeği dizilimi
Solexa veya Illumina gibi araçlar kullanılarak yüksek verimli av tüfeği dizilimi , anne serumu örneği başına yaklaşık 5 milyon dizi etiketi verir . Gebeliğin on dördüncü haftasında test sırasında tespit edilen trizomi gibi anöploid gebelikler . Ebeveyn haplotip analizi ile fetal genom haritasının tamamı, maternal serumdan cffDNA dizilemesi kullanılarak tamamlandı. Hamile dişiler, 2-pleksli büyük ölçüde paralel maternal plazma DNA dizilimi kullanılarak incelendi ve z-skoru 3'ün üzerinde olan trizomi teşhisi kondu. Dizileme, yüzde 100 duyarlılık, yüzde 97.9 özgüllük, yüzde 96,6'lık bir pozitif öngörücü değer ve bir negatif değer verdi . yüzde 100 tahmin değeri .
Kütle spektrometrisi
Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon - PCR'den sonra tek tabanlı uzatma ile birleştirilmiş uçuş süresi kütle spektrometrisi (MALDI-TOF MS) , tek baz özgüllüğü ve tek DNA molekülü duyarlılığı ile cffDNA saptamasına izin verir. DNA, PCR ile amplifiye edilir. Ardından, baz uzatma reaksiyonu ile lineer amplifikasyon (üçüncü bir primer ile) mutasyon bölgesinden yukarı akış bölgesine tavlanacak şekilde tasarlanır . Yabani tip DNA ve mutant DNA'dan iki uzatma ürünü üretmek için uzatma primerine bir veya iki baz eklenir. Tek baz özgüllüğü, TaqMan hidroliz problarını kullanan hibridizasyona dayalı tekniklere göre avantajlar sağlar . Tekniği değerlendirirken, on altı maternal plazma örneğinde fetal cinsiyeti belirlemek için cffDNA aranırken hiçbir yanlış pozitif veya negatif bulunmadı. Doksan bir erkek fetüsün cinsiyeti, MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak doğru bir şekilde tespit edildi. Teknik, yüzde 99'un üzerinde doğruluk, duyarlılık ve özgüllüğe sahipti.
epigenetik modifikasyonlar
Maternal ve fetal DNA arasındaki gen aktivasyon farklılıklarından yararlanılabilir. Epigenetik modifikasyonlar (DNA dizisini değiştirmeden gen fonksiyonunu değiştiren kalıtsal modifikasyonlar) cffDNA'yı tespit etmek için kullanılabilir. Hipermetillendiğinde RASSF1 Bir promotör cffDNA varlığını doğrulamak için kullanılan bir genel fetal belirtecidir. cffDNA'nın maternal plazmadan ekstrakte edildiği ve daha sonra metilasyona duyarlı ve duyarsız kısıtlama enzimleri ile sindirildiği bir teknik tarif edilmiştir . Daha sonra RASSF1A, SRY ve DYS14'ün gerçek zamanlı PCR analizi yapıldı. Prosedür, hipermetile RASSF1A'nın mevcut olduğu 90 anne kan örneğinden 79'unu (yüzde 88) tespit etti.
mRNA
Plasentada eksprese edilen genlerden gelen mRNA transkriptleri anne plazmasında saptanabilir. Bu prosedürde, plazma santrifüjlenir, böylece sulu bir tabaka ortaya çıkar. Bu katman aktarılır ve ondan RNA çıkarılır. RT-PCR , seçilen bir RNA ifadesini saptamak için kullanılır. Örneğin, İnsan plasental laktojeni (hPL) ve beta-hCG mRNA, anne plazmasında stabildir ve saptanabilir. (Ng ve ark. 2002). Bu, maternal plazmada cffDNA varlığının doğrulanmasına yardımcı olabilir.
Uygulamalar
Doğum öncesi cinsiyet ayırt etme
Anne plazmasının bir örneğinden alınan cffDNA'nın analizi, doğum öncesi cinsiyet ayrımına izin verir . Doğum öncesi cinsiyet ayırt etme uygulamaları şunları içerir:
- Hastalık testi : Fetüsün cinsiyetinin erkek veya kadın olup olmadığı , özellikle annenin hastalığın genetik bir taşıyıcısı olduğu durumlarda, belirli bir gebelikte belirli bir X'e bağlı çekinik genetik bozukluk riskinin belirlenmesine izin verir .
- Ebeveynliğin cinsiyete bağlı yönleri için hazırlık .
- Cinsiyet seçimi preimplantasyon genetik tanı sonra gerçekleştirerek implantasyon sonrası yöntemlerinden sonra tercih edilen cinsiyet veya sadece embriyolar seçilerek gerçekleştirilebilir, cinsiyet tercihli kürtaj test sonucu ile kişisel tercih bağlı olarak değişir.
Kıyasla obstetrik ultrasonografi küçük bir risk taşır seks ilk üç aylık kararlılık ve amniyosentez güvenilmez düşük yapma cffDNA analizi için anne plazma örnekleme riski yoktur. cffDNA analizindeki ana hedefler, Y kromozomu ve DYS14 sekansı üzerindeki cinsiyet belirleyici bölge Y proteininden (SRY) sorumlu gendir.
Konjenital adrenal hiperplazi
Gelen konjenital adrenal hiperplazi , adrenal korteks fazla adrenal androjen giden, uygun bir kortikosteroid sentezi yoksun ve dişi fetus etkiler. Dişi fetüslerde cinsel organların dıştan erkekleşmesi vardır. Risk altındaki fetüslerin annelerine, androjenlerin hipofiz bezi salınımını baskılamak için gebeliğin 6. haftasında deksametazon verilir .
Maternal plazma örneğinden elde edilen cffDNA analizinde sadece Y kromozomunda bulunan genetik belirteçler yoksa, bu bir dişi fetüsü düşündürür. Bununla birlikte, analizin kendisinin başarısız olduğunu da gösterebilir (yanlış bir negatif sonuç). Paternal genetik polimorfizmler ve cinsiyetten bağımsız belirteçler, cffDNA'yı saptamak için kullanılabilir. Bu uygulama için bu belirteçlerin yüksek derecede heterozigotluğu mevcut olmalıdır.
babalık testi
Prenatal DNA babalık testi ticari olarak mevcuttur. Test dokuz haftalık gebelikte yapılabilir.
Tek gen bozuklukları
Babadan kalıtılan DNA'nın analiziyle doğum öncesi teşhis edilen otozomal dominant ve çekinik tek gen bozuklukları arasında kistik fibroz , beta talasemi , orak hücreli anemi , spinal müsküler atrofi ve miyotonik distrofi yer alır . Otozomal çekinik mutasyona, anneden kalıtılan otozomal dominant mutasyona veya DNA dizilerinin çoğaltılması, genişletilmesi veya eklenmesini içeren büyük dizi mutasyonlarına bağlı tek gen bozukluklarının doğum öncesi teşhisi daha zordur.
cffDNA'da, tek gen bozukluklarında yer alan 200 – 300 bp uzunluğundaki fragmanların tespit edilmesi daha zordur.
Örneğin, otozomal baskın durum olan akondroplaziye FGFR3 gen noktası mutasyonu neden olur. Akondroplazili bir fetüsü olan iki gebelikte, birinde maternal plazma örneğinden cffDNA'dan babadan kalıtsal bir G1138A mutasyonu ve diğerinde bir G1138A de novo mutasyonu bulunmuştur.
Anne plazma örneklerinden cffDNA'nın qRT-PCR'si kullanılarak Huntington koresinin genetiğiyle ilgili çalışmalarda , normal seviyelerde CAG tekrarları tespit edilmiştir (17, 20 ve 24).
cffDNA, tek gen bozukluklarını teşhis etmek için de kullanılabilir . CffDNA kullanarak laboratuvar süreçlerinde Gelişmeler izin verebilir doğum öncesi tanı ait anöploidiler gibi Trizomi 21 fetüste (Down sendromu).
Fetus ve yenidoğanın hemolitik hastalığı
Fetal ve maternal RhD antijenlerinin uyumsuzluğu , yenidoğanın hemolitik hastalığının ana nedenidir . Kafkasyalı kadınların yaklaşık yüzde 15'i , siyah Afrikalı kadınların yüzde 3 ila 5'i ve Asyalı kadınların yüzde 3'ünden azı RhD negatiftir.
Hastalığın yenidoğan için ölümcül olabileceği ve risk altındaki annelere intramüsküler immünoglobulin (Anti-D) veya intravenöz immünoglobulin içeren tedavi uygulanabileceği için doğru prenatal tanı önemlidir .
9 ila 13. gebelik haftaları arasında anne plazmasından elde edilen cffDNA'dan RHD (gen) gen ekzonları 5 ve 7'yi saptamak için PCR , yenidoğan kordon kanı serumundan RhD belirlemesine kıyasla yüksek derecede özgüllük, duyarlılık ve tanısal doğruluk (> yüzde 90) verir . Ekson 7 ve 10'u hedefleyen benzer sonuçlar elde edildi. Fetal RhD tayininde damlacık dijital PCR, rutin bir gerçek zamanlı PCR tekniği ile karşılaştırılabilirdi.
Maternal serumda cffDNA'dan fetal RhD durumunun rutin olarak belirlenmesi, risk altındaki gebeliklerin erken yönetimini sağlarken gereksiz Anti-D kullanımını yüzde 25'in üzerinde azaltır.
anöploidi
- cinsiyet kromozomları
Yüksek verimli dizileme ile maternal serum cffDNA analizi Turner sendromu , Klinefelter sendromu ve üçlü X sendromu gibi yaygın fetal cinsiyet kromozomu anöploidilerini saptayabilir ancak prosedürün pozitif prediktif değeri düşüktür.
- trizomi 21
Down sendromunun nedeni 21. kromozomun fetal trizomisidir. Bu trizomi, büyük ölçüde paralel pompalı tüfek dizilimi (MPSS) ile anne kanından cffDNA analizi ile tespit edilebilir. Başka bir teknik, seçilen bölgelerin (DANSR) dijital analizidir. Bu tür testler yaklaşık %99 duyarlılık ve %99.9'dan fazla özgüllük gösterir. Bu nedenle, teşhis prosedürleri olarak kabul edilemezler, ancak ilk trimester taraması veya durumun ultrason belirteçleri gibi pozitif bir anne tarama testini doğrulamak için kullanılabilirler.
- Trizomi 13 ve 18
Trizomi 13 veya 18'i arayan MPSS ile maternal plazmadan cffDNA analizi mümkündür
Duyarlılığı ve özgüllüğü sınırlayan faktörler arasında anne plazmasındaki cffDNA seviyeleri; anne kromozomlarında mozaisizm olabilir .
SERPINEB2 mRNA, kaplı B, kromozom 18'den hipometillenmiş SERPINB5, plasentaya özgü 4 (PLAC4), hipermetile holokarboksilaz sentetaz (HLCS) ve kromozom 12'den c21orf105 mRNA dahil olmak üzere aneuploid kromozomlardan türetilen bir dizi fetal nükleik asit molekülü tespit edilebilir. trizomi, anne plazmasındaki mRNA alelleri normal 1:1 oranı değil, aslında 2:1'dir. Epigenetik belirteçler tarafından belirlenen alelik oranlar, tam trizomileri saptamak için de kullanılabilir. Fetal anöploidi tespiti için büyük paralel sekanslama ve dijital PCR, cenin spesifik nükleik asit moleküllerine kısıtlama olmaksızın kullanılabilir. (MPSS)'nin Down sendromunu saptamak için %96 ile %100 arasında bir duyarlılığa ve % 94 ile %100 arasında bir özgüllüğe sahip olduğu tahmin edilmektedir . 10. gebelik haftasında yapılabilir . Amerika Birleşik Devletleri'nde yapılan bir çalışmada Down sendromunu saptamak için cffDNA kullanıldığında % 0,3'lük bir yanlış pozitif oran ve % 80'lik bir pozitif prediktif değer tahmin edilmiştir .
preeklampsi
Preeklampsi , genellikle 20. gebelik haftasından sonra hipertansiyon ve proteinüriyi içeren karmaşık bir gebelik durumudur . Myometriumun zayıf sitotrofoblastik invazyonu ile ilişkilidir . Durumun 20 ila 34. gebelik haftaları arasında başlaması "erken" olarak kabul edilir. Preeklampsi ile komplike olan gebeliklerdeki maternal plazma numuneleri, normal gebeliklerdekinden önemli ölçüde daha yüksek cffDNA seviyelerine sahiptir. Bu, erken başlangıçlı preeklampsi için geçerlidir.
Gelecek perspektifleri
Yeni nesil dizileme , cffDNA'dan tam bir genom dizisi elde etmek için kullanılabilir . Bu etik soruları gündeme getiriyor. Bununla birlikte, spesifik genetik varyantlar ve hastalık durumları arasındaki açık ilişkiler keşfedildikçe prosedürün faydası artabilir.